天然和乙?；矸蹧_壓制成混合材料的酶降解

1、<p>　　天然和乙?；矸蹟D出混合物的酶降解</p><p>　　摘要 包含天然小麥淀粉及乙酰化淀粉（取代度為1.5）的混合物被擠出，可獲得一種新型的包裝材料。同時(shí)利用比色法（對(duì)減少的糖份進(jìn)行測量）和色譜法（測量降解產(chǎn)物的量），對(duì)這種擠出加工對(duì)于混合材料的生物降解能力所產(chǎn)生的影響進(jìn)行研究，以得到一些乙?；矸叟c天然淀粉的比值。-液化淀粉酶（由Aspergillus提供的Fungmyl 800）單獨(dú)

2、使用只能使淀粉的未變性部分產(chǎn)生降解。另一方面，某種乙酰酯酶（由Asperigillus提供的Viscozyme）與同樣的-液化淀粉酶共同作用，則會(huì)使擠出制成混合材料中的兩種主要組分產(chǎn)生顯著的降解。比如說，含有10%的乙?；矸鄣幕旌衔飼?huì)100%地降解。降解的主要產(chǎn)物為葡萄糖（97%），這是因?yàn)閂iscozyme還具有-葡糖甙酶的作用。所以，現(xiàn)今的研究顯示了這種新型包裝材料的可降解特性，即使它有較高的乙?；潭?。©1998 Jo

3、hn Willey & Sons, Ltd.</p><p>　　關(guān)鍵詞：酶降解；淀粉；-液化淀粉酶；乙?；b材料；乙酰作用。</p><p><b>　　簡介：</b></p><p>　　包裝材料構(gòu)造中的天然聚合物對(duì)于不可降解聚合物（聚乙烯和聚丙烯）來說，是一種有趣的替代物，而這些不可降解的聚合物實(shí)際上是這些材料的基本組分。前者應(yīng)

4、用于短期包裝，諸如袋子、農(nóng)用覆蓋膜、瓶子、快餐盒及雞蛋盒等1，這肯定會(huì)有助于減少上述塑料品所帶來的廢品污染。而且，由于運(yùn)輸工業(yè)和廣闊的可開墾牧業(yè)，農(nóng)業(yè)原料的價(jià)值將會(huì)有所提高。</p><p>　　人們已斷言，雖然這些天然聚合物中的某些類別，比如木素，有相對(duì)較長的壽命，但是它們?cè)谧匀粭l件下是可生物降解的2~5。應(yīng)用最為廣泛的天然聚合物為蛋白質(zhì)、類脂物和糖類化合物：</p><p>　　明膠、

5、膠原蛋白、酪蛋白、清蛋白、纖維蛋白原和彈性蛋白；</p><p><b>　　油和脂；</b></p><p>　　纖維素及其衍生物、賽珞玢、硝化纖維素、乙酸纖維素及乙醚纖維素7~8和淀粉。</p><p>　　淀粉看起來是最有前途的聚合物之一：它價(jià)格低廉（2.5~4法郎/千克），而且總的來說是可再生（在歐洲，每年可達(dá)15000000噸）。然而

6、，要將淀粉用作熱塑塑料物質(zhì)，則必須將它徹底粉碎，包括晶狀區(qū)。完全粉碎需要用擠出機(jī)9~11產(chǎn)生一定的機(jī)械張力，以便得到由內(nèi)部大分子束釋放出的高分子鏈。而且，由于溫度的升高及隨之產(chǎn)生的熱塑性能的變化，這種高分子鏈必須被塑化以達(dá)到一定的自由度。這樣，就要在擠出之前加入水及增塑劑。12~13于是，被擠出物變?yōu)樾×罨蚱瑺?，它們后來?jīng)熱成型造出包裝材料。淀粉的很多塑料特性依賴于淀粉的來源：由小麥、玉米、馬鈴薯及稻子所制成的塑料有明顯的不同。直鏈淀

7、粉與支鏈淀粉的比率、脂類與蛋白質(zhì)的含量、增塑劑性能以及條件，都對(duì)塑料的性能及性質(zhì)有一定影響。</p><p>　　這些淀粉基塑料的核心問題是它們的親水性及老化而變脆的趨勢。這個(gè)趨勢與主要從重結(jié)晶現(xiàn)象中產(chǎn)生的新結(jié)構(gòu)有關(guān)。</p><p>　　未變性淀粉表現(xiàn)出極好的親水性，以致于無法用作食品包裝的材料?；瘜W(xué)改良必須本著使它們的疏水性更強(qiáng)的目的進(jìn)行。15這些改性方法包括接枝及烷基化，特別是酯化，

8、包括乙酰化。19所有這些改良都能影響這些變性淀粉的可降解性，尤其是當(dāng)它們被擠出時(shí)。</p><p>　　于是，我們便研究了不同助塑劑和淀粉的化學(xué)改良對(duì)由特定酶作用的被擠出淀粉的水解能力所產(chǎn)生的影響。</p><p><b>　　材料及方法：</b></p><p><b>　　材料：</b></p><

9、p>　　基質(zhì) 小麥淀粉、甘油、硬脂酸鎂及乙酸淀粉（取代度為1.5）由遠(yuǎn)景研究部社團(tuán)（51110 Pomacle，法國）提供。通過熱解重量分析法的研究，第一個(gè)產(chǎn)品含水量約為14%。</p><p>　　原淀粉和乙酰化的淀粉的混合材料（表1）由GREPAC提供并在包裝工程學(xué)校的技術(shù)中心（ESIEC，Reims University, Reims, France）擠出。</p><p>

10、;　　擠出機(jī)器 它是由兩個(gè)基本的機(jī)器組成。</p><p>　　一臺(tái)電阻晶體管邏輯電路型溫控強(qiáng)力攪拌機(jī)，容量為50升，其轉(zhuǎn)速為每分鐘3000轉(zhuǎn)。它具有雙壁結(jié)構(gòu)，能夠?qū)囟瓤刂浦?50℃，而且可以用來制造粉狀組分。它由Scamia公司（91560 Crosnes,France）生產(chǎn)。</p><p>　　一Scamia S2030型單螺桿擠壓機(jī)（圖1）。它由一臺(tái)液壓機(jī)驅(qū)動(dòng)并由相同的廠家生

11、產(chǎn)。這臺(tái)機(jī)器的參數(shù)及性能已出版在他處。20</p><p><b>　　酶</b></p><p>　　-液化淀粉酶 它由Aspergillus oryzae(Fungamyl 800，Novo Industri，Denmark)提供。其活性為800FAU/g（FAU為-液化淀粉酶的單位）溶解態(tài)淀粉。根據(jù)Novo公司的說明，F(xiàn)ungamyl 800的最佳作用條件為

12、：pH介于5.0~5.5,溫度介于50~55℃。</p><p>　　乙酰酯酶 根據(jù)Castanares的測定方法21，曲霉菌素（Viscozyme, Novo Society）的發(fā)酵液體具有相當(dāng)于42U/ml乙酰酯酶的活性。實(shí)驗(yàn)條件為pH 7.0，溫度30℃，對(duì)硝基乙酸苯做基質(zhì)。利用滲透極限為30kDa的防滲膜超濾器能夠使我們富集乙酰酯酶（因?yàn)樗目朔肿恿?gt;30kDa），而且通過去除大部分的低聚糖，能

13、夠使發(fā)酵液體純化。</p><p><b>　　方法：</b></p><p>　　對(duì)擠出物質(zhì)所含乙?；矸郯俜直鹊姆治?在100oC培養(yǎng)箱中每0.1g擠出物質(zhì)用5ml 6mol/l的NaOH溶液水解。定時(shí)取樣，用高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行分析。當(dāng)介質(zhì)中沒有乙酸繼續(xù)進(jìn)入時(shí)，便認(rèn)為變性淀粉中所有的乙?；鶊F(tuán)都被水解了。</p><p>　　

14、用液化淀粉酶水解前的擠出準(zhǔn)備 將由擠出而得的顆粒狀物置于配有抗氧化刀的磨碎機(jī)（20000轉(zhuǎn)/分鐘，Polylabo A35101型）中進(jìn)行研磨。為了研究均相同一的粉末，我們將所得物過篩，截留到直徑為0.250~0.125mm的小顆粒。在水解之前，將粉末放入60℃的烘箱內(nèi)干燥至恒重。然后將它們放入室溫環(huán)境下的干燥皿中。</p><p>　　酶試驗(yàn) 為了計(jì)算生物降解率，進(jìn)行了兩次酶試驗(yàn)。</p>

15、<p>　　在第一個(gè)試驗(yàn)中，由0.1mol/l的磷酸緩沖液（pH=5）制成的淀粉溶液（25g/l）用-液化淀粉酶在50℃培養(yǎng)，該酶由Aspergillys oryzae提供，其E/S比率為1:26。根據(jù)Novo的觀點(diǎn)，反應(yīng)混合物中的Ca2+可用來使Fungmyl 800保持穩(wěn)定。于是，濃度為40p.p.m.的CaCl2溶液便被用來加入反應(yīng)以使反應(yīng)達(dá)到令人滿意的穩(wěn)定性。</p><p>　　在第二個(gè)試驗(yàn)

16、中，由磷酸緩沖液制成的淀粉溶液（25g/l）在相同的溫度下用兩種酶進(jìn)行培養(yǎng)：由Aspergillus oryzae出品E/S比值為1:26的-液化淀粉酶和由Aspergillus niger出品地21U/ml的乙酰酯酶。在Coma及其合作者所做的研究22中，將這兩中反應(yīng)混合物置于振動(dòng)恒溫浴皿中（每分鐘振動(dòng)50次,Salvis），經(jīng)過不同的水解時(shí)間后，從反應(yīng)混合物中取出幾個(gè)125ml的等量樣品，然后用HCl將其pH調(diào)至3，以使其活性減弱，

17、而后在100℃下的干燥器中熱干燥10分鐘。冷卻后，以10000轉(zhuǎn)/分鐘的速度在4oC下離心5分鐘。</p><p>　　比色法 水解過程中，不同的反應(yīng)混合物中所產(chǎn)生的糖份減少通過Somogyi-Nelson法23進(jìn)行測定。</p><p>　　HPLC法 采用與Coma等方法22相同的步驟，利用HPLC（model 8880,TSP,Les Ulis,France）對(duì)淀粉水解產(chǎn)物進(jìn)

18、行糖份分析。乙酸也是利用同樣的裝置，采用規(guī)格300x7.8mm、保持在35℃的Aminex Hpx 87H柱（Biorad, Ivry/Seine,France）進(jìn)行HPLC法分析。將由硫酸（0.02mol/l）組成的流動(dòng)相通過0.2µm的濾器進(jìn)行脫氧。在900磅/英寸2的壓力下保持0.6ml/min的流速。乙酸用紫外分光光度計(jì)（TSP 8880,Les Ulis,France）進(jìn)行測量。注入樣品量為20µl。在注入

19、之前，用0.22mm的濾器（Millipore Corp.）將樣品過濾。將三個(gè)重復(fù)試驗(yàn)所得的相關(guān)濾液綜合分析。采用不同濃度的乙酸溶液，便制成了第一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。</p><p>　　利用比色法進(jìn)行的生物降解百分比的測量 利用Somogyi-Nelson法23所得的數(shù)據(jù)，正如Copinet等24所做工作一樣，我們可以計(jì)算生物降解百分比（%BDE）。采用如下關(guān)系式：</p><p>　　%B

20、DE = 實(shí)際生產(chǎn)葡萄糖等值量(g) /理論葡萄糖等值量(g) x 100</p><p>　　利用HPLC法 通過HPLC法進(jìn)行的研究可使我們計(jì)算得到如下結(jié)果：</p><p>　　可通過如下關(guān)系式對(duì)每種聚合度（d.p.n.）的葡萄糖聚合物的生物降解百分比進(jìn)行分析：</p><p>　　%BHPLC = 某聚合度的葡萄糖聚合物的實(shí)際量(g) /理論葡萄糖量(g

21、) x100</p><p>　　生物降解總百分比可表達(dá)為∑d.p.n.(%BHPLC)。</p><p><b>　　結(jié)果與討論：</b></p><p>　　對(duì)擠出材料的初步分析 在變性淀粉的取代度保持在限定范圍內(nèi)（取代度1.5）的情況下，對(duì)含原淀粉和乙酰化淀粉的不同混合物的擠出是可行的。而且，可以說這兩種組分是兼容的，不象天然淀粉與

22、其它一些變性聚合物，比如醋酸纖維素混合20那樣。乙酰淀粉不是處于被擠出材料的表面，而是與材料的整體處于均相狀態(tài)。而且，我們實(shí)驗(yàn)室中以前的研究20表明，這種組分在擠出過程中不可降解。并且因此能夠保持在濕環(huán)境下的強(qiáng)度不會(huì)發(fā)生像醋酸纖維素那樣的變脆現(xiàn)象。</p><p>　　然而，乙?；疤烊坏矸鄣臄D出加工必須要有熱（120℃）及機(jī)械壓力。我們需要查明它們是否易于脫酰化。表2向我們展示了各種不同混合物在擠出過程中產(chǎn)生的

23、輕度脫?；?。變化范圍是：含乙?；矸?00%和50%的混合物，其脫?；嚷蕿?%；含乙?；矸?0%的混合物為11%。接下來的計(jì)算將乙?；俜直鹊倪@些減少考慮在內(nèi)。</p><p>　　通過Fungamyl 800 -液化淀粉酶進(jìn)行的生物降解</p><p>　　用比色法（降解測定）繼續(xù)研究 由圖2知，當(dāng)混合物中乙?；矸鄣暮可邥r(shí)，生物降解百分比減?。簭臒o乙酰淀粉時(shí)的56%降至10

24、0%乙?；蟮?1%。</p><p>　　另一方面，除了部表現(xiàn)這一相的含100%乙?；矸鄣幕旌衔锿?，降解曲線的線性部分，即快速水解相，幾乎同樣都時(shí)前30分鐘。這個(gè)結(jié)果意味著酶對(duì)未變性淀粉的親和性沒有因乙?；矸鄣拇嬖诙艿郊s束。實(shí)際上，在擠出過程中乙?；矸鄯植嫉娜缦聝煞N情況是可能的。</p><p>　　圖2 、在含不同程度乙?；矸鄣谋粩D出淀粉的水解過程中，生物降解百分率（%BDE

25、）。測定條件：-液化淀粉酶（E/S為1:26，含25%被擠出淀粉），pH 5，溫度50℃繪制點(diǎn)為三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中：◆，0%；■，10%；▲，20%；×，30%；●，50%；+，100%。</p><p>　　在整個(gè)定量混合中，混合物是均相的。在這個(gè)例子中，酶對(duì)未變性淀粉的親和性不會(huì)降低，于是，生物降解的初始速度不會(huì)下降。</p><p>　　被擠出混合物為非均相。與混合物的疏水

26、部分相應(yīng)的乙酰化淀粉就會(huì)移到被擠出物的邊緣。混合物的生物可降解部分與酶的親和性將會(huì)變差，生物降解的初始速度將會(huì)降低。</p><p>　　由于我們沒有發(fā)現(xiàn)初始速度降低的現(xiàn)象，我們認(rèn)為第一種假設(shè)是正確的。</p><p>　　用HPLC法繼續(xù)研究 在被擠出混合物水解過程中由Fungmyl 800的水解作用所釋放出的不同多糖酶的變化百分比（d.p.n.）見表3。</p>&l

27、t;p>　　第一、含天然淀粉的不同混合物所釋放出的主要產(chǎn)物為麥芽糖（dp2），最高為67%（混合物中無變性淀粉，x=0），最低為40%（x=50）。</p><p>　　第二、生物降解為葡萄糖的最終百分比介于0到30%的%BHPLC(x)值為20%。這表明了影響淀粉葡萄糖酶作用效率的典型特點(diǎn)，與Coma及其同事22所指出的相符合。該值還解釋了當(dāng)x=100時(shí)，為什么葡萄糖會(huì)是主要分解產(chǎn)物的原因。</p&

28、gt;<p>　　第三、當(dāng)x<30%時(shí)，生物降解率[∑d.p.n.(%BHPLC)]高于90%。當(dāng)x=100時(shí)，總生物降解率僅為17%。在比色分析中，這些結(jié)果表明所用酶不能生物降解被擠出混合物中的乙酰化部分。</p><p>　　圖4還顯示了生物降解百分比（%BDE和%BHPLC）隨時(shí)間變化顯著曲線。由此可知，對(duì)于一種給定的液化淀粉酶，如果只知道乙?；陌俜直?，我們就有可能斷定這種混合物的生物

29、降解百分比。</p><p>　　更進(jìn)一步地講，當(dāng)混合物中乙酰化淀粉的百分比升高時(shí)，由圖3可知，由比色法和由色譜法所得的生物降解曲線將會(huì)聚一點(diǎn)。實(shí)際上，在水解過程中，乙酰化淀粉百分比的增加使大面積的低聚糖基質(zhì)的釋放變難。只有小的低聚糖能被釋放，主要為葡萄糖（dp1）。關(guān)系式（1）和（2）表明，當(dāng)葡萄糖為水解的唯一產(chǎn)物時(shí)，%BDE和%BHPLC會(huì)給出相同結(jié)果。</p><p>　　乙酸酶酯和

30、Fungmyl 800對(duì)擠出乙?；矸鄣膮f(xié)和作用</p><p>　　用比色法（測量降解）繼續(xù)研究 由-液化淀粉酶和乙酰酯酶共同作用所得的生物降解百分比高于由-液化淀粉酶單獨(dú)作用所得的百分比。舉例來說，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，x=10%的%BDE值分別為98%和54%，其他x值也確定了這種差別，特別當(dāng)x=100時(shí)（分別為27%和11%）。這些結(jié)果清楚地表明了這兩種酶之間的協(xié)和作用。</p><p>

31、;　　用HPLC法繼續(xù)的糖份研究 對(duì)被擠出混合物（表4）在水解過程中釋放的不同產(chǎn)物進(jìn)行的分析表明，主要的糖是葡萄糖（dp1）。它的百分比要比單獨(dú)用Fungmyl 800（表3）所得百分比高得多。根據(jù)Coma及其同事22的觀點(diǎn)，在Fungmyl 800的制備中，加入-葡糖甙酶能得到大約20%的葡萄糖。表3中的結(jié)果能夠證實(shí)這一點(diǎn)。因此，由這兩種酶（比如說x=10%時(shí)為97%，表4）所得的最高值必然來自Viscozyme溶液中所含的額外的-

32、葡糖甙酶的作用。事實(shí)上，這種作用已通過將-pNPG作為基質(zhì)而進(jìn)行強(qiáng)調(diào)了。在pH5.0、溫度50℃的條件下所得值為1.0U/ml。因此，這兩個(gè)-葡糖甙酶的活性便解釋了麥芽糖（dp2）水解為葡萄糖的過程。</p><p>　　乙酸的釋放 圖5表示了相應(yīng)的曲線。首先，當(dāng)混合物中乙?；矸鄣陌俜直龋▁）降低時(shí)，被釋放乙酸的百分比增加（比如：x=22時(shí)為88%，x=100時(shí)為10%）。這樣，未變性淀粉的存在就方便了乙酸

33、的作用。</p><p>　　其次，切斷葡萄糖甙鏈必須在它們脫酰之前或同時(shí)進(jìn)行，因?yàn)獒尫懦龅钠咸烟潜３种咭阴；?。故?dāng)?shù)矸鄣淖冃圆糠謨H有57%脫酰（圖5）時(shí)，x=20%的淀粉幾乎完全被轉(zhuǎn)化為葡萄糖（94%，表4）。</p><p><b>　　結(jié)論：</b></p><p>　　當(dāng)前的工作著重于研究天然的和乙酰化的（取代度1.5）淀粉混合物可能

34、的擠出工作。做為潛在的包裝材料，這些混合物具有較高的生物可降解性。確實(shí)，當(dāng)單獨(dú)用-液化淀粉酶或用-液化淀粉酶和乙酰酯酶的混合物進(jìn)行水解時(shí)，被擠出物會(huì)表現(xiàn)出令人感興趣的生物降解潛力。舉例來說，混合物乙?；俜直葹?0%，根據(jù)比色法及色譜法，對(duì)由酶混合物引起的生物降解測定，其值分別為67（圖4）和69%（表4）。這樣，我們就可以假定這樣的材料在自然環(huán)境下會(huì)很快降解，因?yàn)樗芯康拿溉∽源罅康奈⑸?，比如Aspergillus niger。所以

35、，對(duì)這些合成擠出材料的降解時(shí)間的測評(píng)將會(huì)變得很有趣。</p><p>　　參照標(biāo)準(zhǔn)樣品20，對(duì)這些材料所吸收拉伸能的測定表明了同乙酰纖維素相比的乙?；矸鄣乃芑瘎┳饔?。而且，在溫度20℃相關(guān)濕度40%的條件下存放一周后，含乙?；矸鄱嘤?0%的樣品沒有裂痕，這是因?yàn)橐阴；矸垡丫鶆蚍植加诓牧?，其?nèi)部約束力也有所減少。然而，隨著x值的增加，材料的疏水性并為有所增加。確實(shí)，即使x值為50%時(shí)，由于乙?；矸垲w粒的均勻

36、分布，材料的疏水性仍不充分。</p><p>　　乙?；矸鄣募尤肽軌蚋纳撇牧系臋C(jī)械性能，而且不影響被擠出混合材料的生物降解能力，但卻不能有效提高它的疏水性。將提高機(jī)械性能和降低生物可降解能力兩方面綜合考慮，混合材料的x值應(yīng)為50%。但是，將它用于包裝材料則需要較好的疏水性，因?yàn)椴牧现刑烊坏矸鄄糠治?，能?dǎo)致微生物的繁衍和材料的提前降解。鑒于此，我們正試圖制備一種600µm厚度的復(fù)合壓片，它的中間層為

37、淀粉，外層為由乙?；矸邸⒕酆涎蹑溚樗狨ズ投嗳樗針?gòu)成的生物可降解表皮。</p><p><b>　　致謝：</b></p><p>　　本項(xiàng)研究得益于Conseil Général de la Marne 的經(jīng)濟(jì)支持，并在Europol` Argo 范圍內(nèi)完成。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)：</b&

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