天然和乙酰化淀粉擠出混合物的酶降解 中文版

1、<p>　　Packing Technology and Science 11, 69-81 (1998)</p><p>　　Enzymatic Degradation of Native and Acetylated Starch-based Extruded Blends</p><p>　　天然和乙?；矸蹟D出混合物的酶降解</p><p>　　A

2、lain copinet1*, Véronique Coma2, Jean Paul Onteniente1 and Yves Couturier1</p><p>　　1 Group de Recherche en Emballage du Produit Alimentaire et compatibilité(GREPAC-ESIEC) BP 1029, 51686 Reims Cede

3、x 2, France</p><p>　　2 Laboratoire de Recherche en Génie Industriel Alimentaire, Technopole de Génie Industriel Alimentaire, 01060 Bourg en Bresse Cedex 9, France</p><p><b>　　摘要&

4、lt;/b></p><p>　　擠出包含天然小麥淀粉及乙?；矸郏ㄈ〈葹?.5）的混合物，獲得一種新型的包裝材料。同時利用比色法（對減少的糖份進(jìn)行測量）和色譜法（測量降解產(chǎn)物的產(chǎn)量），對應(yīng)用擠出加工工藝對于混合材料的生物降解能力的影響進(jìn)行了研究，得到一些乙?；矸叟c天然淀粉的比值。單獨(dú)使用-液化淀粉酶（由Aspergillus提供的Fungmyl 800）只能使淀粉的未變性部分產(chǎn)生降解。另一方面，某種乙

5、酰酯酶（由Asperigillus提供的Viscozyme）與上述的-液化淀粉酶共同作用，則會使擠出制成的混合材料中的兩種主要組分發(fā)生顯著的降解。比如說，含有10%的乙?；矸鄣幕旌衔飼?00%地降解。降解的主要產(chǎn)物為葡萄糖（97%），這是因?yàn)閂iscozyme還具有-葡糖甙酶的作用。所以，本文研究了這種新型包裝材料的降解特性，其中也包括具較高乙酰化比例的淀粉。©1998 John Willey & Sons, Ltd

6、.</p><p>　　關(guān)鍵詞：enzymatic degradation; starch; -amylase; acetylated packaging material; acetylation.</p><p><b>　　簡介</b></p><p>　　以天然聚合物替代包裝材料中的基本組分——不可降解聚合物（聚乙烯和聚丙烯），是一個使

7、人們十分感興趣的課題。將天然聚合物應(yīng)用于短期包裝，諸如袋子、農(nóng)用地膜、瓶子、快餐盒及雞蛋盒等1，肯定會有助于減少上述塑料品所帶來的廢品污染。而且，由于運(yùn)輸工業(yè)和廣闊的可開墾牧業(yè)存在，其作為農(nóng)業(yè)原料的價值也將會有所提高。</p><p>　　人們認(rèn)為，雖然天然聚合物中的某些品種，比如木素，有相對較長的使用壽命，但是它們在自然條件下是可生物降解的2~5。應(yīng)用最為廣泛的天然聚合物為蛋白質(zhì)、類脂物和糖類化合物：</

8、p><p>　　明膠、膠原蛋白、酪蛋白、清蛋白、纖維蛋白原和彈性蛋白；</p><p><b>　　油和油脂；</b></p><p>　　纖維素及其衍生物、賽珞玢、硝化纖維素、乙酸纖維素及乙醚纖維素7~8和淀粉。</p><p>　　淀粉看起來是最有前途的聚合物之一：價格低廉（2.5~4法郎/千克），而且總的來說是可再生資

9、源（在歐洲，每年有15000000噸產(chǎn)量）。然而，要將淀粉用作熱塑性材料，必須將它徹底粉碎，包括結(jié)晶區(qū)。完全粉碎需要使用擠出機(jī)9~11用一定的機(jī)械張力使內(nèi)部大分子束釋放出高分子鏈。而且，由于溫度的升高及隨之產(chǎn)生的熱塑性能的變化，這種高分子鏈會被塑化達(dá)到一定的自由度。最后，在擠出之前要加入水及增塑劑12~13。擠出物為小粒狀或片狀，經(jīng)熱成型制成包裝材料。淀粉的很多塑性取決于淀粉的來源，由小麥、玉米、馬鈴薯及稻子中的淀粉所制成的塑料有明顯的

10、不同。直鏈淀粉與支鏈淀粉的比率、脂類與蛋白質(zhì)的含量、增塑劑性能以及擠出條件，都對塑料的性能及物性有一定影響。</p><p>　　這些淀粉基塑料研究的核心問題是它們的親水性及老化變脆的趨勢。這個趨勢主要與重結(jié)晶產(chǎn)生的新結(jié)構(gòu)有關(guān)。</p><p>　　未變性淀粉表現(xiàn)出極好的親水性，以致于無法用作食品包裝材料?；瘜W(xué)改性必須本著增強(qiáng)它們的疏水性的目的進(jìn)行15。這些改性方法包括接枝及烷基化，特別是

11、酯化(包括乙?；?9)。所有這些改良都能影響這些變性淀粉的可降解性，尤其是當(dāng)它們被擠出時。</p><p>　　因此，我們研究了不同增塑劑和淀粉的化學(xué)改性(由特定酶作用)對擠出的淀粉混合物的水解能力的影響。</p><p><b>　　材料及方法</b></p><p><b>　　材料</b></p>&l

12、t;p>　　基質(zhì) 小麥淀粉、甘油、硬脂酸鎂及乙酸淀粉（取代度為1.5）由遠(yuǎn)景研究部社團(tuán)（51110 Pomacle，法國）提供。通過熱解重量分析，小麥淀粉含水量約為14%。</p><p>　　原淀粉和乙?；矸鄣幕旌喜牧希ū?）由GREPAC提供并在包裝工程學(xué)校的技術(shù)中心（ESIEC，Reims University, Reims, France）擠出。</p><p>　　擠

13、出機(jī)械 由兩臺基本的機(jī)器組成。</p><p>　　一臺電阻晶體管邏輯電路型溫控強(qiáng)力攪拌機(jī)，容量為50升，其轉(zhuǎn)速為每分鐘3000轉(zhuǎn)。具有雙壁結(jié)構(gòu)，能夠升溫，并控制在150℃，產(chǎn)品為粉末狀。由Scamia公司（91560 Crosnes,France）生產(chǎn)。</p><p>　　一臺Scamia S2030型單螺桿擠出機(jī)（圖1）。由一臺液壓機(jī)驅(qū)動(為相同廠家產(chǎn)品)。其它文獻(xiàn)20也報道過這

14、臺機(jī)器的參數(shù)及性能。</p><p><b>　　酶</b></p><p>　　-液化淀粉酶 由曲霉素Aspergillus oryzae(Fungamyl 800，Novo Industri，Denmark)中提取。其活性為800FAU/g（FAU為-液化淀粉酶的單位）溶解態(tài)淀粉。根據(jù)Novo公司的說明，F(xiàn)ungamyl 800的最佳活性條件為：pH介于5.0

15、~5.5,溫度介于50~55℃。</p><p>　　乙酰酯酶 根據(jù)Castanares方法測定21，曲霉菌素（Viscozyme, Novo Society）的發(fā)酵液體可產(chǎn)生活性為42U/ml乙酰酯酶。實(shí)驗(yàn)條件為pH 7.0，溫度30℃，用對硝基乙酸苯做基質(zhì)。用滲透極限為30kDa的防滲膜超濾器富集乙酰酯酶（因?yàn)樗目朔肿恿?gt;30kDa），并且通過去除大部分的低聚糖，能夠使發(fā)酵液體純化。通過二次過濾可

16、以獲得157.5U/ml活性的乙酰酯酶。</p><p><b>　　方法</b></p><p>　　對擠出物料中所含乙酰化淀粉百分比的分析 在100℃培養(yǎng)箱中將每0.1g擠出物料用5ml 6mol/l的NaOH溶液水解。定時取樣，用高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行分析。當(dāng)介質(zhì)中不再有乙酸進(jìn)入時，便認(rèn)為變性淀粉中所有的乙?；鶊F(tuán)都被水解了。</p>&

17、lt;p>　　用液化淀粉酶水解前的擠出準(zhǔn)備 將擠出的顆粒狀物置于配有抗氧化刀的磨碎機(jī)（20000轉(zhuǎn)/分鐘，Polylabo A35101型）中進(jìn)行研磨。為了獲得均一的粉料，我們將所得物過篩，截留直徑為0.250~0.125mm的小顆粒。水解之前，將粉末放入60℃的烘箱內(nèi)干燥至恒重。然后將它們放入室溫環(huán)境下的干燥器中。</p><p>　　酶試驗(yàn) 為了計算生物降解率，進(jìn)行了兩種酶試驗(yàn)。</p&g

18、t;<p>　　在第一個試驗(yàn)中，在淀粉溶液（25g/l）中加入0.1mol/l的磷酸鹽緩沖液（pH=5），并加入-液化淀粉酶在50℃培養(yǎng)，該酶由曲霉菌素Aspergillys oryzae提取，E/S比率為1:26。根據(jù)Novo的觀點(diǎn)，反應(yīng)混合物中的Ca2+可使Fungmyl 800－液化淀粉酶保持穩(wěn)定。因此，加入濃度為40p.p.m.的CaCl2溶液可使反應(yīng)達(dá)到令人滿意的穩(wěn)定程度。</p><p>

19、;　　在第二個試驗(yàn)中，由磷酸鹽緩沖液配制的淀粉溶液（25g/l）在相同的溫度下用兩種酶進(jìn)行培養(yǎng)：由曲霉菌素Aspergillus oryzae提取，E/S比值為1:26的-液化淀粉酶；由曲霉素Aspergillus niger提取的活性為21U/ml的乙酰酯酶。在Coma及其合作者所做的研究22中，將這兩種反應(yīng)混合物置于恒溫振動水浴中(每分鐘振動50次,Salvis），在不同的水解時間后，分別從反應(yīng)混合物中移取幾次125ml的等量樣品，

20、分別用HCl將pH調(diào)至3，使其活性減弱，而后在100℃下的干燥器中干燥10分鐘。冷卻后，以10000轉(zhuǎn)/分鐘的速度在4oC下離心5分鐘(離心機(jī)為Jouan MR1822型)。</p><p>　　比色法 水解過程中，不同的反應(yīng)混合物中所產(chǎn)生的糖份減少量可通過Somogyi-Nelson法23進(jìn)行測定。</p><p>　　HPLC法 采用與Coma等人22論述的步驟，利用HPLC（

21、model 8880,TSP,Les Ulis,France）對淀粉水解產(chǎn)物進(jìn)行糖份分析。乙酸也是利用同樣的裝置，采用規(guī)格300×7.8mm、35℃的Aminex Hpx 87H柱（Biorad, Ivry/Seine,France）進(jìn)行HPLC法分析。由硫酸（0.02mol/l）組成的流動相通過濾徑為0.2µm的過濾器進(jìn)行脫氧。流動相在900磅/英寸2的壓力下保持0.6ml/min的流速。乙酸用紫外分光光度計（TS

22、P 8880,Les Ulis,France）進(jìn)行測量。注入樣品量為20µl。在注入之前，用濾徑0.22mm的過濾器（Millipore Corp.）將樣品過濾。取三份濾液做平行測定。首先采用不同濃度的乙酸溶液(Sogma Chemical Co，St Louis，Mo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。</p><p>　　利用比色法進(jìn)行生物降解百分率的測量 利用Somogyi-Nelson法23所得的數(shù)據(jù)，計算生

23、物降解百分比（%BDE），正如Copinet等24所做工作一樣。采用如下關(guān)系式：</p><p>　　%BDE = 實(shí)際生產(chǎn)葡萄糖等值量(g) /理論葡萄糖等值量(g) x 100 (1)</p><p>　　利用HPLC法 通過HPLC法進(jìn)行研究,得到如下結(jié)果：</p><p>　　可通過如下關(guān)系式對每種聚合度（d.p.n.）的葡萄糖聚合物的生物降解百分

24、比進(jìn)行分析：</p><p>　　%BHPLC = 某聚合度的葡萄糖聚合物的實(shí)際量(g) /理論葡萄糖量(g) ×100 (2)</p><p>　　生物降解總百分比可表達(dá)為∑d.p.n.(%BHPLC)。</p><p><b>　　結(jié)果與討論</b></p><p>　　擠出材料初步分析 當(dāng)變性淀

25、粉的取代度保持在限定范圍內(nèi)(取代度≤1.5），對含原淀粉和乙?；矸鄣牟煌旌衔镞M(jìn)行擠出是可行的。而且，可以說這兩種組分是兼容的，不象天然淀粉與其它一些變性聚合物，比如醋酸纖維素混合物20那樣。乙酰淀粉不處于擠出材料的表面，而是與材料整體處于均相狀態(tài)。而且，我們實(shí)驗(yàn)室以前的研究也20表明，這種組分在擠出過程中不會發(fā)生降解，因此在成品制造過程中強(qiáng)度無任何下降，不會發(fā)生像醋酸纖維素那樣的變脆現(xiàn)象。</p><p>　

26、　然而，乙?；疤烊坏矸鄣臄D出加工必須要有熱（120℃）及機(jī)械壓力條件。因此，必須驗(yàn)證它們是否易于脫酰化。表2向我們展示了不同混合物在擠出過程中發(fā)生的輕度脫酰化。變化范圍是：乙酰化淀粉含量為100%和50%的混合物，脫酰化比率為5%；乙酰化淀粉含量為20%的混合物，脫?；嚷蕿?1%。下面的計算應(yīng)將乙酰化百分比的減少考慮在內(nèi)。</p><p>　　圖2 、不同含量乙酰化淀粉擠出混合物的水解過程中，生物降解百分率（

27、%BDE）。測定條件：-液化淀粉酶（E/S為1:26，含25%被擠出淀粉），pH 5，溫度50℃繪制點(diǎn)為三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中：◆，0%；■，10%；▲，20%；×，30%；●，50%；+，100%。</p><p>　　通過Fungamyl 800 -液化淀粉酶進(jìn)行的生物降解</p><p>　　用比色法繼續(xù)研究(降解測定） 由圖2可知，當(dāng)混合物中乙?；矸鄣暮可邥r，生物降

28、解百分比減?。簭臒o乙酰淀粉時的56%降至100%乙酰化淀粉時的11%。</p><p>　　另一方面，在降解曲線的線性部分，即快速水解階段，所有混合物最初30分鐘內(nèi)降解曲線一樣，除了乙酰化淀粉含量為100%的混合物(因?yàn)樗鼰o此快速降解階段)。這個結(jié)果表明酶對未變性淀粉的親和性并不受乙酰化淀粉的影響。實(shí)際上，在擠出過程中乙?；矸鄯植即嬖谌缦聝煞N情況可能性。</p><p>　　在原料，混合

29、物是均相的。在這個例子中，酶對未變性淀粉的親和性不會降低，因此，生物降解的初始速度不會下降。</p><p>　　擠出混合物為非均相。與混合物的疏水部分親和的乙酰化淀粉就會移到擠出物的邊緣。混合物的可生物降解部分與酶的親和力變差，生物降解的初始速度將會降低。</p><p>　　由于我們沒有發(fā)現(xiàn)初始速度降低的現(xiàn)象(圖2)，我們認(rèn)為第一種假設(shè)是正確的。</p><p>

30、;　　用HPLC法繼續(xù)研究 擠出混合物在-液化淀粉酶Fungmyl 800的作用下水解轉(zhuǎn)化為不同多糖，百分比（d.p.n.）見表3。</p><p>　　第一、含天然淀粉的混合物轉(zhuǎn)化的主要產(chǎn)物為麥芽糖(dp2），最高可達(dá)67%(混合物中無變性淀粉，x=0)，最低為40%（x=50）。</p><p>　　第二、BHPLC(x)值x介于0到30%的混合物，最終轉(zhuǎn)化為葡萄糖(dpl)的百分

31、比為20%。這是淀粉葡糖甙酶轉(zhuǎn)化淀粉的典型特征，如Coma及其同事22以前所強(qiáng)調(diào)的一樣。最終活性也可解釋當(dāng)x=100(既全部為乙酰化淀粉)時，葡萄糖是主要分解產(chǎn)物的這一現(xiàn)象。</p><p>　　表3、在擠出淀粉混合物的酶水解過程，隨著乙?；矸郏╠p1，葡萄糖；dp2，麥芽糖；dp>3，糊精）所占百分比x增加，水解生成的碳?xì)浠衔铮?BHPLC）的變化。</p><p>　　測定條

32、件：-液化淀粉酶E/S比率為1:26，含25%被擠出淀粉，pH值為5，溫度50℃。</p><p>　　第三、當(dāng)x<30%時，最終生物降解總率[∑d.p.n.(%BHPLC)]高于90%。另一方面當(dāng)x=100時，總生物降解率僅為17%。在比色分析中，這些結(jié)果表明擠出混合物中的乙?；糠植荒鼙凰妹干锝到狻?lt;/p><p>　　圖4還顯示了生物降解百分率(%BDE和%BHPLC)隨時

33、間變化的曲線。由此可知，對于一種給定的液化淀粉酶，如果我們只知道混合物中乙?；陌俜直龋陀锌赡軘喽ㄟ@種混合物的生物降解百分率。</p><p>　　更進(jìn)一步地講，在圖3中，當(dāng)混合物中乙酰化淀粉的百分比升高時，，由比色法和由色譜法所得的生物降解曲線將會聚一點(diǎn)。實(shí)際上，在水解過程中，乙酰化淀粉百分比的增加會使大分子量的低聚糖的轉(zhuǎn)化變得困難。只能轉(zhuǎn)化為小分子量的低聚糖，主要為葡萄糖（dp1）。關(guān)系式（1）和（2）表明

34、，當(dāng)葡萄糖為水解的唯一產(chǎn)物時，%BDE和%BHPLC會得出相同結(jié)果。</p><p>　　乙酰酯酶和Fungmyl 800對擠出乙酰化淀粉的協(xié)和作用</p><p>　　用比色法繼續(xù)研究(測量降解） 由-液化淀粉酶和乙酰酯酶共同作用所得的生物降解百分率高于由-液化淀粉酶單獨(dú)作用所得的百分比。舉例來說，試驗(yàn)結(jié)束時，x=10%的BDE值分別為98%和54%，其他x值也有這種差別，特別當(dāng)x=

35、100時（分別為27%和11%）。這些結(jié)果清楚地表明了這兩種酶之間發(fā)生了協(xié)和作用。</p><p>　　用HPLC法繼續(xù)糖份研究 對擠出混合物（表4）在水解過程中釋放的不同產(chǎn)物進(jìn)行分析表明，主要產(chǎn)物是葡萄糖（dp1）。它的百分比要比單獨(dú)用Fungmyl 800（表3）所得百分比高得多。根據(jù)Coma及其同事22的觀點(diǎn)，F(xiàn)ungamyl 800酶液中加入-葡糖甙酶能得到大約20%的葡萄糖。表3中的結(jié)果能夠證實(shí)這一點(diǎn)

36、。因此，這兩種酶（比如說x=10%時轉(zhuǎn)化率為97%，表4）作用所得的最高轉(zhuǎn)化率必然包含有Viscozyme酶液中所含的附加的-葡糖甙酶的作用。事實(shí)上，這種活性作用已通過用-pNPG作為基質(zhì)進(jìn)行加強(qiáng)了。在pH5.0、溫度50℃的條件下活性值為1.0U/ml。因此，這兩個-葡糖甙酶的活性便可解釋麥芽糖（dp2）水解為葡萄糖(dpl)的過程。</p><p>　　乙酸的釋放 圖5表示了相應(yīng)的曲線。首先，當(dāng)混合物中乙

37、?；矸鄣陌俜直龋▁）降低時，乙酸的釋放量的百分比增加（比如：x=22時為88%，x=100時為10%）。這樣，未變性淀粉可以提高乙酰酯酶的活性。其次，切斷葡萄糖甙鏈必須在它們脫酰之前或同時進(jìn)行，因?yàn)獒尫懦龅钠咸烟潜３种咭阴；?。故?dāng)?shù)矸鄣淖冃圆糠謨H有57%脫酰（圖5）時，x=20%的淀粉幾乎完全被轉(zhuǎn)化為葡萄糖（94%，表4）。</p><p><b>　　結(jié)論</b></p>

38、<p>　　當(dāng)前的工作著重于研究天然的和乙?；模ㄈ〈?.5）淀粉混合物的擠出工作。做為潛在的包裝材料，這些混合物具有較高的生物可降解性。事實(shí)上，當(dāng)單獨(dú)用-液化淀粉酶或用-液化淀粉酶和乙酰酯酶的混合物進(jìn)行水解時，被擠出物會表現(xiàn)出令人感興趣的生物降解潛力。舉例來說，混合物乙酰化百分比為50%，根據(jù)比色法及色譜法，對酶混合物引起的生物降解進(jìn)行測定，其值分別為67％（圖4）和69%（表4）。這樣，我們就可以假定這樣的材料在自然環(huán)

39、境下會很快降解，因?yàn)槲覀兯芯康拿甘怯纱蠖鄶?shù)普通的微生物中提取，比如曲霉菌素Aspergillus niger。所以，對這些擠出材料在堆肥條件下的降解時間的測評將會十分很有趣。</p><p>　　與標(biāo)準(zhǔn)樣品20相比，這些材料具有不同的機(jī)械性能。不同擠出混合物拉伸性能的測定表明了同乙酰纖維素相比乙?；矸劭勺鳛樗芑瘎┦褂?。而且，在溫度20℃，相關(guān)濕度40%的條件下存放一周后，含乙酰化淀粉多于20%的樣品沒有裂痕，

40、這是因?yàn)橐阴；矸垡丫鶆蚍植加诓牧现校鋬?nèi)部約束力也有所減少。然而，隨著x值的增加，材料的疏水性未能有所增加。事實(shí)上，即使x值為50%時，由于乙?；矸垲w粒的均勻分布，材料的疏水性仍不充分。</p><p>　　乙酰化淀粉的加入能夠改善材料的機(jī)械性能，而且不影響被擠出混合材料的生物降解能力，但卻不能有效提高它的疏水性。將提高機(jī)械性能和降低生物可降解能力兩方面綜合考慮，混合材料的x值應(yīng)為50%。但是，將它用于包裝材

41、料則需要較好的疏水性，因?yàn)椴牧现刑烊坏矸鄄糠治螅軐?dǎo)致微生物的繁衍和材料的提前降解。鑒于此，我們正試圖制備一種600µm厚度的復(fù)合壓片，它的中間層為淀粉，外層為由乙酰化淀粉、聚合氧鏈烷酸酯和多乳酸構(gòu)成的可生物降解表皮。</p><p><b>　　致謝</b></p><p>　　本項(xiàng)研究得益于Conseil Général de l

42、a Marne 的經(jīng)濟(jì)支持，并受Europol` Argo 構(gòu)想所進(jìn)行。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　Roper, H. and Koch, R. The role of starch in biodegradable thermoplastic materials, Stärke 42, 123-130 (1990).

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