茶樹葉片抗寒相關(guān)蛋白的篩選.pdf

1、植物在低溫作用下由于基因表達(dá)的改變而誘發(fā)合成新蛋白質(zhì)。這些新蛋白質(zhì)具有高度的親水性和熱穩(wěn)定性，能夠保護(hù)植物細(xì)胞免受低溫傷害。目前，人們對大多數(shù)植物進(jìn)行了抗冷性誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，均發(fā)現(xiàn)低溫脅迫會引起植物細(xì)胞中可溶性蛋白質(zhì)含量發(fā)生變化，并有特異蛋白的產(chǎn)生，且與植物的抗寒性密切相關(guān)。
　　 茶樹葉片中蛋白質(zhì)的含量約占干物重的25％，其中大部分存在于細(xì)胞質(zhì)中或與膜不緊密結(jié)合，可以用極性溶劑(如水、稀酸、稀堿或稀鹽溶液)進(jìn)行提取，這部分蛋白質(zhì)統(tǒng)稱

2、為可溶性蛋白質(zhì)，包括熱穩(wěn)定和熱不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，主要為各種酶及一些生理活性蛋白。茶樹在受到低溫脅迫時，其葉片組織細(xì)胞會以分解組蛋白或是其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化的方式積累大量可溶性蛋白，用此方式來增加細(xì)胞液的濃度從而降低細(xì)胞液的冰點(diǎn)以抵抗低溫環(huán)境。
　　 茶樹是多酚、色素含量特別高的植物，在葉片研磨時，茶多酚又極易氧化，形成大量的氧化產(chǎn)物，這些物質(zhì)嚴(yán)重干擾著電泳過程。本實(shí)驗(yàn)對茶樹葉片采用丙酮干粉制備法，改良丙酮沉降法和三氯乙酸-丙酮制干粉法三種蛋

3、白質(zhì)提取方法，并對SDS-PAGE電泳結(jié)果進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)利用改良丙酮沉降法提取蛋白，不僅提取效率高，而且雜質(zhì)干擾少，得到的電泳結(jié)果，蛋白條帶清晰，數(shù)量多。利用這一方法對冷馴化下不同品種茶樹葉片抗寒相關(guān)蛋白進(jìn)行了研究，在云抗43和舒茶早中分別發(fā)現(xiàn)了與抗寒相關(guān)的23kd下調(diào)蛋白和51kd上調(diào)蛋白，獲得了滿意的蛋白SDS-PAGE分析結(jié)果。
　　 進(jìn)一步對一年生舒茶早枝條進(jìn)行4℃低溫處理三天后，提取葉片的蛋白質(zhì)，進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn)

4、，并用PDQuest軟件分析比較舒茶早枝條葉片在低溫處理下的蛋白表達(dá)譜，得到了46個量變倍數(shù)大于 1.5倍的差異斑點(diǎn)，其中低溫處理上調(diào)表達(dá)的蛋白點(diǎn)有31個，減弱表達(dá)的蛋白點(diǎn)有15個，推測這些差異蛋白點(diǎn)可能與低溫脅迫相關(guān)。
　　 根據(jù)資料，茶樹蛋白的等電點(diǎn)一般集中在4-6.5，綜合雙向電泳圖譜上蛋白點(diǎn)的重復(fù)性，分離度，表達(dá)量各因素，選取7個蛋白點(diǎn)用基質(zhì)輔助激光解吸／電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI—TOFMS)進(jìn)行肽質(zhì)量指紋譜的分析，