煙粉虱在健康和感毒煙草上的基因差異表達(dá)分析及蟲體超氧化物歧化酶的初步研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、煙粉虱Bemisia tabaci廣泛分布于各大洲的多個國家和地區(qū),自20世紀(jì)80年代后期,具入侵性的煙粉虱Middle East-Asia Minor1(MEAM1)隱種(該隱種近年來通稱為B型煙粉虱)開始在多個國家和地區(qū)棉花、西葫蘆、甘藍(lán)等蔬菜及一品紅等作物上暴發(fā)成災(zāi),造成巨大損失。MEAM1隱種的入侵?jǐn)U張往往又伴隨著雙生病毒的蔓延成災(zāi)及新雙生病毒的出現(xiàn),煙粉虱-雙生病毒間的互惠共生很可能在雙生病毒的流行及煙粉虱的迅速擴張中起了重要

2、作用。為深入了解煙粉虱與雙生病毒間互惠共生產(chǎn)生的機制以及這種關(guān)系在外來煙粉虱入侵中的作用,本研究以煙粉虱MEAM1隱種-中國番茄黃曲葉病毒(Tomatoyellow leafcurl China virus,TYLCCNV)-煙草為模式系統(tǒng),篩選MEAM1隱種在帶毒和健康煙草上取食后的差異表達(dá)基因,并結(jié)合分子生物學(xué)方法對相關(guān)基因展開研究,嘗試從分子水平探討此模式系統(tǒng)中產(chǎn)生的互惠共生現(xiàn)象的內(nèi)在機制,為煙粉虱及其傳播的雙生病毒的防治提供理論

3、基礎(chǔ)。本研究的結(jié)果如下:
   (1)MEAM1隱種取食健康和帶毒煙草后蟲體內(nèi)的差異表達(dá)基因
   以煙粉虱MEAM1隱種-TYLCCNV-煙草為模式系統(tǒng),采用抑制消減雜交(suppression subtractive hybridization,SSH)方法進(jìn)行雙向篩選,得到MEAM1隱種在TYLCCNV侵染煙草上取食后的124個上調(diào)的表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)(正向文庫,Forward library)及112個下調(diào)

4、ESTs(反向文庫,Reverse library)。將正反向文庫中的ESTs和GenBank中的序列進(jìn)行同源性分析比對,發(fā)現(xiàn)多個基因可能與雙生病毒-煙粉虱之間的直接互作相關(guān)。如正向文庫中的26/29 kDa蛋白水解酶、類肝素硫酸蛋白聚糖(laeparan sulfate proteoglycan,HSPG)、煙粉虱次生共生菌立克次氏體及銅鋅超氧化物歧化酶(copper/zinc superoxide dismutase,CuZnSOD

5、)。結(jié)合先前的研究報道,推測26/29 kDa蛋白水解酶可能參與并協(xié)助清除煙粉虱體內(nèi)的病毒粒子;HSPG基因的上調(diào)也可能有助于TYLCCNV成功侵入煙粉虱細(xì)胞;次生共生菌立克次氏體相關(guān)基因的上調(diào)則可能與煙粉虱應(yīng)對TYLCCNV染產(chǎn)生的防御反應(yīng)相關(guān)。同時,實驗結(jié)果表明,煙粉虱取食帶毒煙草后,其體內(nèi)的CuZnSOD基因表達(dá)上調(diào),推測產(chǎn)生的機制可能是雙生病毒進(jìn)入MEAM1后,蟲體內(nèi)的活性氧增加,激活了機體的抗氧化系統(tǒng)應(yīng)對病毒侵染。鑒于SOD在

6、生物體抗氧化脅迫中的重要作用,結(jié)合本研究的結(jié)果及實驗室在煙粉虱抗氧化酶和雙生病毒侵染關(guān)系方面的前期工作基礎(chǔ),本課題的后續(xù)工作選擇了煙粉虱的CuZnSOD基因做進(jìn)一步研究。
   (2)煙粉虱CuZnSOD(Bt-CuZnSOD)的克隆、表達(dá)、純化及蟲體酶活測定
   為從分子水平深入了解SOD在煙粉虱-雙生病毒及煙草互作中可能的積極作用,本實驗克隆、表達(dá)并純化了MEAM1體內(nèi)的CuZnSOD,測定了純化后Bt-CuZnS

7、OD蛋白的酶活熱穩(wěn)定性,同時研究了在高低溫脅迫下MEAM1體內(nèi)Bt-CuZnSOD酶活的相應(yīng)變化情況。實驗首先通過Rapid Amplification of cDNAEnds(RACE)技術(shù)獲得Bt-CuZnSOD的cDNA全長,并與其它多個物種的CuZnSOD比較后明確其具備典型的CuZnSOD特征:四個銅結(jié)合位點,四個鋅結(jié)合位點,兩個與二硫鍵形成相關(guān)的半胱氨酸及兩個銅鋅信號位點。利用各個物種CuZnSOD序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明B

8、t-CuZnSOD為胞內(nèi)CuZnSOD。同時,使用GST融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)成功對目的基因進(jìn)行原核表達(dá)與純化,最終得到純化的Bt-CuZnSOD蛋白并通過檢測證明了其活性。最后,實驗設(shè)置了高低溫處理條件,并明確在高溫和低溫脅迫條件下蟲體內(nèi)Bt-CuZnSOD的活性都顯著上升。推測入侵亞熱帶地區(qū)的MEAM1能在極端溫度下正常生存,可能與其體內(nèi)CuZnSOD能高效去除高溫環(huán)境下產(chǎn)生的過多氧自由基密切相關(guān)。
   本研究結(jié)果明確了TYLC

9、CNV可通過直接或間接方式對帶毒煙草上取食的煙粉虱體內(nèi)基因產(chǎn)生顯著影響,同時克隆并利用原核表達(dá)系統(tǒng)在體外成功表達(dá)了煙粉虱CuZnSOD基因,并獲得純化后具活性的Bt-CuZnSOD蛋白,且初步研究了其在逆境脅迫下的生理功能。推測在煙粉虱-雙生病毒-煙草三者互作過程中,MEAM1隱種基因表達(dá)譜的變化可能對煙粉虱的生殖力和存活率等生物學(xué)特征產(chǎn)生積極作用,從而產(chǎn)生互惠共生現(xiàn)象。本實驗研究結(jié)果對于深入探討雙生病毒與煙粉虱間的互惠共生現(xiàn)象的分子機

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