豬源TTV-分子流行病學,全長序列分析及感染性分子克隆的構(gòu)建.pdf

1、輸血傳播病毒(Torque teno virus，TTV)是一種小的，無囊膜的，單股環(huán)狀負鏈的DNA病毒，目前該病毒被歸于圓環(huán)病毒科的指環(huán)病毒屬。TTV是繼甲、乙、丙、戊型肝炎病毒之后又發(fā)現(xiàn)的一種新型肝炎病毒。該病毒最早是由日本學者于1997年從一例輸血后發(fā)生急性感染的非甲～戊型肝炎病人血清中發(fā)現(xiàn)的，因而被稱輸血傳播病毒。調(diào)查發(fā)現(xiàn)TTV在人群中感染率很高，在豬、牛、羊、貓、狗等多種動物體內(nèi)也相繼發(fā)現(xiàn)有TTV的感染。
　　 豬源T

2、TV在全世界大部分豬場都具有很高的感染率，引起了人們的廣泛關(guān)注。目前的流行病學調(diào)查顯示，豬源TTV和豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒共感染可誘發(fā)豬的皮膚腎炎綜合癥，和豬圓環(huán)病毒共感染可誘發(fā)斷奶仔豬代謝綜合癥，還可能與豬圓環(huán)病毒或豬戊型肝炎病毒共同誘發(fā)豬的傳染性肝炎。由于豬源TTV具有潛在的危害，目前對此病毒的了解非常少，因此對其進行相關(guān)的研究是非常必要的。
　　 本文根據(jù)GenBank上發(fā)表的PCV2基因組序列和TTV1和TTV2的非

3、編碼區(qū)(UTR)序列設(shè)計合成引物，分別建立了用于檢測PCV2和TTV1、TTV2的PCR及巢式PCR方法。對來自廣東、福建和江西等7個省份的258份血液樣品和組織樣品進行了檢測，結(jié)果表明豬群中TTV1和TTV2感染總陽性率分別為37.6％和82.6％，二者的混合感染率為34.5％。94份樣品表現(xiàn)為PCV2和TTV1的混合感染，占樣品總數(shù)的36.4％；193份樣品表現(xiàn)為PCV2和TTV2的混合感染，占74.8％；另外，還有一些樣品為三重感

4、染，占34.5％。挑選部分陽性樣品用套式PCR引物擴增出TTV1和TTV2的部分UTR片段，并將擴增出的部分UTR基因與已報道的TTV1和TTV2的UTR序列進行比較分析。分析結(jié)果顯示本研究獲得的TTV1毒株之間的UTR核苷酸同源性為80.8％-98.5％，TTV2毒株之間的UTR核苷酸同源性為94.2％-100％，而與參考株相比同源性分別為82.7％-100％和95.5％-99.1％。本研究從基因水平證實我國豬群中存在TTV的感染，提

5、示我們TTV對豬群是一個不容忽視的新病原，并且確定了豬群中PCV2與TTV1和/或TTV2混合感染情況。
　　 從流行病學調(diào)查為陽性樣品中選取其中病毒滴度高的樣品，進行全長序列的擴增，測序過程中發(fā)現(xiàn)，在TTV1和TTV2基因組中均存在一段高GC并且有特殊結(jié)構(gòu)的區(qū)域，導(dǎo)致測序結(jié)果不理想。針對這一問題，分別設(shè)計了2對和3對覆蓋TTV1和TTV2全長的套式PCR引物，對陽性樣品進行擴增，獲得了7株全長序列，3株TTV1，4株TTV2。

6、將所得到的TTV序列與GenBank中的10株參考序列進行核苷酸和氨基酸的比對和分析，核苷酸比對結(jié)果顯示，獲得的豬源TTV1和TTV2之間的同源性不到10％，TTV1分離株之間的核苷酸同源性為94.6-96.5％，與參考序列的同源性為61.5-98.3％，TTV2分離株之間的核苷酸同源性為92.4-94.8％，與參考序列之間的同源性為85.4-96.2％。氨基酸比對結(jié)果顯示，TTV1分離株的ORF1，2，3的氨基酸同源性均97.5％以上

7、，但與參考序列的同源性則分成了兩種情況，與AB076001和GU456383參考序列的同源性在97.5％以上，而與其他4株參考序列的同源性則不到50％。TTV2分離株的ORF1，2，3的氨基酸同源性均在88.3％以上，而和參考序列的同源性均在80％以上，只與參考序列GU88046 ORF3的同源性出現(xiàn)了低于50％的例外。通過比較分析也發(fā)現(xiàn)，TTV三個ORF的氨基酸同源性普遍低于核苷酸的同源性。與此同時，還發(fā)現(xiàn)核苷酸同源性大于90％的TT

8、V序列之間，存在高頻率的G/A堿基互換，在TTV1的ORF1中，其互換率在40-57.6％之間，ORF2的互換率在50-60％之間，明顯高于其他堿基之間的互換率，而在TTV2中核苷酸同源性大于90％的序列只有兩株，其ORF1的G/A的互換率為27.7％和42.9％，高于其它堿基的互換，在ORF2中，互換率為60％，明顯高于其他堿基的互換率。進一步的研究表明去甲基化能明顯減小測序困難，其中對FJ/China/2010/TTV2/2的測序完

9、全正常，對FJ/China/2010/TTV2/2的全長序列進行了GC島、DNA二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測和甲基化水平分析，結(jié)果表明，在FJ/China/2010/TTV2/2的難測區(qū)和高GC區(qū)均存在復(fù)雜的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，但沒有G-C對的甲基化。
　　 對豬源TTV2中的假想蛋白ORF1，ORF2進行原核表達，由于ORF1 N端含有大量疏水氨基酸，因此對ORF1進行了截短，即ORF1a，表達結(jié)果顯示ORF1a為包涵體，ORF2為可溶性蛋白。通過包

10、涵體純化和谷胱甘肽親和層析(GST)純化獲得高純度的可溶性重組蛋白，將純化的ORF1a蛋白和ORF2蛋白免疫BALB/c小鼠制備抗血清，ELISA效價可達1:6000。另外，分別將TTV2的ORF1，ORF2和ORF3克隆到真核表達載體3×Flag中，構(gòu)建了重組的真核表達質(zhì)粒3×FLAG-ORF1，ORF2和ORF3。將其轉(zhuǎn)染細胞，通過自制抗體的間接免疫熒光(IFA)試驗證明了自制抗體的有效性，且通過3×FLAG標簽抗體的IFA對三個假

11、想蛋白進行了細胞定位，結(jié)果顯示ORF1蛋白是核定位的，ORF2蛋白分布在整個細胞，ORF3蛋白主要集中在核漿中，在核仁的外圍尤為明顯。
　　 由于豬源TTV在豬體內(nèi)的含量比較低，目前還沒有能夠支持其復(fù)制的細胞系，所以其分子機制和生物學的研究一直受到限制。為了研究豬源TTV的一些關(guān)鍵的分子生物學活性(如轉(zhuǎn)錄和復(fù)制)，本研究分段擴增了FJ/China/2010/TTV2/2的全長序列，該序列全長2796個核苷酸，與最早分離出的TTV

12、2原型Sd-TTV2p(AY823991)的同源性為85.4％，用該序列構(gòu)建出了分別含有1.0個，1.3個，2.0個全長基因組的載體為pSK的質(zhì)粒。通過將構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK15細胞，48h后的Northern Blot實驗，驗證了三個主要閱讀框的存在和ORF3剪切的發(fā)生：通過基于酶切的Southern Blot實驗進行了病毒復(fù)制的研究，沒有檢測到構(gòu)建質(zhì)粒在PK15細胞中的復(fù)制；用自制ORF1a，ORF2抗體，通過間接免疫熒光實驗檢測構(gòu)建質(zhì)