人胎盤源間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中免疫原性上調(diào)的研究-免疫學(xué)

1、<p><b>　　摘 要</b></p><p>　　目的：探討間充質(zhì)干細胞（MSCs）在成骨分化過程中的免疫原性改變及其分子機制。</p><p>　　方法：用酶消化法獲得人胎盤源間充質(zhì)干細胞（PMSCs），并對其進行鑒定后，分別在體外和體內(nèi)條件下，誘導(dǎo)其成骨分化。體內(nèi)外成骨誘導(dǎo)7天后用流式細胞術(shù)（FCA）分別檢測細胞表面協(xié)同刺激分子的表達情況；同時用

2、成骨誘導(dǎo)后的細胞分別與T細胞共培養(yǎng)，3H-TdR摻入法或CCK8方法檢測T細胞的增殖。利用茜素紅染色、ALP活性檢測、micro-CT、H&E染色等方法檢測MSCs體內(nèi)外成骨效應(yīng)，分析成骨效應(yīng)。</p><p>　　結(jié)果：1）成功分離培養(yǎng)PMSCs ；2）體內(nèi)外實驗均顯示PMSCs成功向成骨細胞分化，未分化的PMSCs 不表達CD28、CD80、CD83、CD86、B7DC等正性共刺激分子，但經(jīng)成骨誘導(dǎo)分

3、化后其表達上調(diào)；并且成骨誘導(dǎo)分化后的PMSCs促進了T細胞增殖，而未誘導(dǎo)分化的PMSCs則未能促進；3）PMSCs在體內(nèi)成骨分化后CD28、CD80、CD83、CD86、B7DC等正性共刺激分子上調(diào)程度較PMSCs在體外成骨更高。</p><p>　　結(jié)論：未分化的PMSCs具有低免疫原性，但是在經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化后其免疫原性上調(diào)；PMSCs在體內(nèi)成骨分化過程中，免疫原性上調(diào)程度較體外成骨分化高。這對于間充質(zhì)干細胞今

4、后在臨床的應(yīng)用有很好的參考價值。</p><p>　　關(guān)鍵詞：胎盤源間充質(zhì)干細胞；成骨誘導(dǎo)；協(xié)同刺激分子；T細胞增殖</p><p>　　Study on upreguleted immunogenicity of human placenta-derived mesenchymal stem cells during osteogenesis </p><p>&

5、lt;b>　　Abstract</b></p><p>　　Objective To investigate the alteration of mesenchymal stem cells’ immunogenicity and involved molecular mechanisms during osteogenesis. </p><p>　　Methods

6、Human placenta-drived mesenchymal stem cells(PMSCs) were isolated from human placenta by trypsin-digesting. After being confirmed by flowcytometer (FCM) and chondro- and adipogenic differentiation they were induced to o

7、steoblastes in vivo and vitro respectively. The costimulatory molecules were detected by FCMbefore and after PMSCs were induced in osteogenic medium for 7 days in vitro. Meanwhile, the expressions of costimulatory molecu

8、les were also detected by FCM at 7 days after PMSCs</p><p>　　Results 1) The PMSCs were prepared successfully. 2) The results showed that PMSCs can differentiate into osteoblasts well both in vitro and in viv

9、o. The induced cells upregulated the expressions of positive costimulatory molecules including CD28, CD80, CD83, CD86, B7DC and so on, and they also promoted T cell proliferation. PMSCs are immuno-privileged in vitro. Bu

10、t their immunogenicity could be upregulated during osteogenic defferentiation. 3) There was higher expression of the costimulatory mol</p><p>　　Discussion PMSCs are immuno-privileged in vitro. But their immu

11、nogenicity could be upregulated during osteogenic defferentiation. The immunogenicity of the induced-PMSCs in vivo was higher than that induced in vitro. This should be fully considered when MSCs are applied in clinic.&l

12、t;/p><p>　　Key words：placenta-derived mesenchymal stem cells；osteogenesis；costimulatory molecules；T cell proliferation</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　前 言1</b&g

13、t;</p><p>　　第一部分 人胎盤間充質(zhì)干細胞的分離與鑒定.............................................................7</p><p>　　材料和方法...................................................................................

14、.............................7</p><p><b>　　結(jié) 果9</b></p><p><b>　　結(jié) 論11</b></p><p>　　第二部分 PMSCs在體外誘導(dǎo)分化成骨過程中免疫原性的變化13</p><p><b>　　材料和方法

15、13</b></p><p><b>　　結(jié) 果15</b></p><p><b>　　結(jié) 論18</b></p><p>　　第三部分 PMSCs在體內(nèi)誘導(dǎo)分化成骨過程中免疫原性的變化21</p><p><b>　　材料和方法21</b></

16、p><p><b>　　結(jié) 果23</b></p><p><b>　　結(jié) 論26</b></p><p><b>　　討 論27</b></p><p><b>　　總結(jié)和展望32</b></p><p><b&g

17、t;　　綜 述33</b></p><p>　　碩士研究生期間完成的論文45</p><p>　　中英文對照縮略詞表46</p><p><b>　　致 謝47</b></p><p><b>　　前 言</b></p><p>　　在骨科臨床上，骨

18、不連和骨缺損等的治療是經(jīng)常面臨的難題，據(jù)統(tǒng)計，我國每年因各種原因造成的骨缺損病人超過100萬，骨移植在臨床是僅次于輸血的同種異體組織移植[1]。造成骨損傷的原因是多方面的，如創(chuàng)傷、腫瘤、退化性病變、骨質(zhì)丟失等[2,3]，由于骨的特殊結(jié)構(gòu)組織，生物學(xué)和生物力學(xué)特點，目前的治療手段并不足以恢復(fù)損傷部位原有的結(jié)構(gòu)和功能，大范圍骨缺損的修復(fù)目前仍是十分棘手的問題。目前在我國和其他大部分國家和地區(qū)，自體骨仍是植骨材料的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是由于骨來源非

19、常有限，可能難以滿足大段骨損傷的修復(fù)，而且取骨后可能會造成取骨區(qū)的各種并發(fā)癥，從而給患者帶來額外痛苦；同種異體骨移植雖然相對較易獲得材料，但是其效果遠遠不如自體骨移植，且存在疾病傳播的問題[4]；異種骨移植雖然在成本、來源等方面都有優(yōu)勢，但是潛在的動物疾病可能帶來更大的風(fēng)險[5]。現(xiàn)在，間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells,MSCs）在組織工程學(xué)的應(yīng)用為解決這些問題提供了新的曙光。</p><p

20、>　　間充質(zhì)干細胞是干細胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)為非造血組織干細胞，由于其具有可分化為間充質(zhì)組織細胞的能力，故稱之為間充質(zhì)干細胞[6]。目前在幾乎所有組織中都可以分離得到，包括脂肪、骨、心臟、腦、外周血、胎盤、臍血、羊水等[7-11]。MSCs具有強大的自我更新能力，這一特性使其在相當(dāng)長的時間內(nèi)能產(chǎn)生與自身完全相同的細胞，有時甚至是在組織或器官的整個生命期。MSCs極易分化為軟骨細胞、成骨

21、細胞和脂肪細胞[12]，此外MSCs還可分化為肌肉、韌帶、胰島、心肌、神經(jīng)元細胞等其他組織細胞[13-16]。在連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后，MSCs仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變等引起的組織器官損傷修復(fù)。具有獨特的低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能是MSCs最大的特點也是其最主要優(yōu)點之一，據(jù)研究，MSCs可通過調(diào)控樹突狀細胞（DCs）、NK細胞、T、B細胞功能和旁分泌方式等多種途徑抑制免疫應(yīng)答[17-19]。因此，在器官、組

22、織損傷后的修復(fù)及自身免疫性疾病的治療中，MSCs成為理想的異基因首選，并在多種疾病的治療中得到證實：如它能治療擴張型心肌病[20]；</p><p>　　近幾年，由于MSCs獨特的免疫原性吸引了很多基礎(chǔ)和臨床研究人員的關(guān)注。據(jù)有關(guān)報道，利用MSCs免疫調(diào)節(jié)作用治療疾病的研究已經(jīng)在許多動物模型和人類疾病患者中開展，很多MSCs的試驗已經(jīng)進入臨床[33]。目前研究表明未分化的MSCs具有很好的免疫抑制功能，但是最新的

23、研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSCs并不是總能抑制免疫排斥的發(fā)生，它在一些情況下同樣能夠促進免疫應(yīng)答的發(fā)生[34]。還有一些研究顯示由于MSCs在體內(nèi)加深了免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致了治療的失敗：Sudres M等[35]發(fā)現(xiàn)MSCs在體外可以抑制T細胞增殖，但是在體內(nèi)沒能阻止移植手術(shù)后的小鼠發(fā)生GvHD；Nauta AJ 等[36]將MSCs與異基因骨髓同時移植到受輻射后的小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)MSCs可導(dǎo)致實驗組移植入的骨髓細胞明顯減少；Inoue S 等[37]

24、將MSCs與環(huán)孢霉素A（免疫抑制劑）共同使用，卻加速了小鼠移植模型的排斥反應(yīng)的發(fā)生；Hoogduijn MJ 等[38]的研究發(fā)現(xiàn)MSCs能恢復(fù)受藥物抑制后的PBMCs的正常增殖；豬的異體MSCs在體外沒有免疫致敏性，但經(jīng)心腔注射同時激發(fā)了細胞免疫和體液免疫應(yīng)答，導(dǎo)致皮膚移植失敗[39]。Huan</p><p>　　這些研究均提示MSCs在不同微環(huán)境的定向分化過程中會有免疫原性上調(diào)的現(xiàn)象發(fā)生。因此，我們推測這種

25、免疫原性的上調(diào)導(dǎo)致了移植物在體內(nèi)最終因激活宿主免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，影響MSCs在體內(nèi)的存活、分化、組織再生和功能重建，使得MSCs的替代治療失敗。所以，研究MSCs及其在定向分化過程中免疫特性的改變和生物學(xué)作用，闡明分子機制，尋找有效的干預(yù)手段，對MSCs在臨床上應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。</p><p>　　綜上所述，MSCs具有的多向分化潛能及低免疫原性、負性調(diào)節(jié)的特性使得MSCs成為再生醫(yī)學(xué)中較為理想的種子

26、細胞。但新的證據(jù)表明，MSCs在定向分化過程中免疫原性上調(diào)，改變甚至終止MSCs的進一步分化和功能重建，其中涉及的作用機制和解決手段尚不明確，專門針對分化后的MSCs的研究目前還未有相關(guān)報道，這為MSCs在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用帶來了新的挑戰(zhàn)。課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)人骨髓源MSCs在成軟骨分化過程中CD83、CD80、CD86、B7H3等分子表達增加，上調(diào)細胞免疫原性進而刺激T細胞增殖作用[41]。那么胎盤源的MSCs是否存在不同的免疫原性和分

27、化特性？免疫原性是否會在分化過程中發(fā)生上調(diào)？這是本研究中需要證明的主要問題，而且將要進一步做體內(nèi)實驗，來觀察分析MSCs在體內(nèi)與體外的分化是否會有區(qū)別，為MSCs將來在臨床的應(yīng)用收集和提供更多的數(shù)據(jù)。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1]Williams A, Szabo RM. Bone transplantation. Ort

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62、;/b></p><p><b>　?。ㄒ唬┎牧?lt;/b></p><p><b>　　1．材料與儀器</b></p><p>　　二氧化碳培養(yǎng)箱（Sanyo公司，日本），離心機(TD5A-WS，湘儀公司，中國），倒置相差顯微鏡（IX71型， OLYMPUS 公司，日本），單人雙面超凈臺（SW-CJ-1F 型，蘇州凈化

63、集團，中國），流式細胞儀（FC 500FCL，Beckman Coulter，美國），微量移液槍（Eppendorf公司，德國），恒溫水浴鍋(HH-S2型，國立常州實驗設(shè)備研究所，中國)，培養(yǎng)皿（D=9cm，Coming公司，中國），6、24孔細胞培養(yǎng)板（Coming公司，中國），15ml、50ml離心管（Coming公司，中國），剪刀，鑷子，酒精燈。</p><p><b>　　2．試劑</b&

64、gt;</p><p>　　DMEM低糖培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國)，胎牛血清（Hyclone公司，美國），胰蛋白酶（Sigma公司，美國），鼠抗人CD34（PE標(biāo)記）、CD 45（FITC標(biāo)記）、CD73（PE標(biāo)記）、CD105（PE標(biāo)記）、CD90（PE標(biāo)記）、CD116（PE標(biāo)記）、CD166（PerCP標(biāo)記）、HLA-DR（PE標(biāo)記）單克隆抗體(eBioscience公司，美國)， L-抗壞血酸（S

65、igma公司，美國），胰島素（Sigma公司，美國），地塞米松（Sigma公司，美國），β-磷酸甘油鈉（Sigma公司，美國），IBMX（Sigma公司，美國），油紅（Sigma公司，美國），茜素紅染液（Sigma公司，美國），甲胺苯藍染液（Sigma公司，美國）。</p><p><b>　?。ǘ┓椒?lt;/b></p><p>　　1．PMSCs的分離獲取 <

66、;/p><p>　　無菌條件下取足月剖腹產(chǎn)胎兒的胎盤(按醫(yī)院規(guī)定，并經(jīng)家屬同意)，將胎盤胎兒面的蛻膜組織， 用Hank’s沖洗3次，將組織剪成1mm3～2mm3碎片，加入0.1%Ⅳ型膠原酶，37℃ 水浴消化30min，然后用DMEM中和并充分吹打，過100目篩網(wǎng)、研磨，收集細胞懸液，以1200rpm/min離心5min，加入完全培養(yǎng)基(包括LG-DMEM，10%FBS)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3天進行換

67、液，待細胞鋪滿至瓶底80%時進行傳代。培養(yǎng)三代后的細胞經(jīng)鑒定后可用于實驗。</p><p>　　2．流式細胞儀檢測細胞表面分子</p><p>　?、儆跓o菌操作臺中，用0.025%胰蛋白酶消化收集待測細胞，將細胞分裝于流式管中，調(diào)整細胞量為1×105個/管；</p><p>　　②1200rpm/min離心5分鐘，棄上清；</p><p

68、>　　③將流式管置于冰上，每管加入熒光標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體1μl，避光孵育20-30 min，每5min輕輕搖晃流式管；</p><p>　?、苊抗芗尤牒?%胎牛血清的PBS 800μl，1200rpm/min離心清洗2遍，棄上清；</p><p>　?、菝抗芗尤?00μl PBS懸浮細胞，并用移液器輕輕吹打混勻，然后利用FC 500FCL流式細胞儀（Beckman Coulter

69、）進行檢測，所得數(shù)據(jù)用FlowJo version 7.6.2 軟件進行處理分析。</p><p>　　3. 成脂肪細胞誘導(dǎo)分化</p><p>　　無菌條件下，將培養(yǎng)3代以后的細胞按5×104個/孔種植于6孔培養(yǎng)板中，待生長至40%～50%滿時，吸去完全培養(yǎng)基，每孔加入成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基(DMEM、10%FBS、IBMX 50mmol/L、胰島素1 mg/L、地塞米松0.1μmo

70、l/L、吲跺美辛200μmol/L) 2.5ml，進行成脂肪細胞誘導(dǎo)分化，每3d進行半量換液，約10d～15d后進行油紅染色檢測。</p><p>　　①取油紅O0.5g溶于100ml異丙醇中，配成油紅飽和染液，取油紅飽和液6ml加蒸餾水4ml，靜置15min備用；②取誘導(dǎo)14d的待測細胞，吸去誘導(dǎo)液，再用PBS洗2-3遍；③加入10%中性甲醛，固定30-60min；④吸去固定液，加入油紅染色液，避光條件下染色1

71、5-20min；⑤用PBS清洗兩次，去除殘留的染色液；⑥加入PBS，完成染色，于顯微鏡下觀察著色情況（脂肪會呈現(xiàn)鮮紅色）。</p><p>　　4. 成骨細胞誘導(dǎo)分化 </p><p>　　無菌條件下，取培養(yǎng)3代以后的細胞種于6孔板中，密度為5×104個/孔，待細胞完全貼壁后，吸去完全培養(yǎng)基，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (DMEM、10%FBS、L-抗壞血酸 50μg/ml、β-磷酸甘

72、油鈉 10mmol/ml、地塞米松 10-8 mmol/ml)進行成骨細胞誘導(dǎo)分化，每3d進行半量換液，約20d進行茜素紅染色檢測。</p><p>　　①取0.1g茜素紅，加蒸餾水定容至100ml，調(diào)整pH為7.5；②取成骨誘導(dǎo)21d的細胞，吸去誘導(dǎo)液，用PBS洗2-3遍；③加入10%中性甲醛，固定30-60min；④吸去固定液，加入0.1%的茜素紅染色液，染色15-20min；⑤用PBS清洗兩次，去除殘留的染

73、色液；⑥加入PBS，完成染色，于顯微鏡下觀察著色情況（茜素紅會和鈣發(fā)生顯色反應(yīng)，成骨誘導(dǎo)成功的細胞外面沉積的鈣結(jié)節(jié)會被染成深紅色）。</p><p>　　成軟骨細胞誘導(dǎo)分化 </p><p>　　無菌條件下，取培養(yǎng)3代以后的細胞種于6孔板中，密度為5×104個/孔，待細胞完全貼壁后，吸去完全培養(yǎng)基，每孔加入成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基2.5ml（胰島素 0.5ug/ml、抗壞血酸 50μM/

74、ml、TGF-β 10ng/ml）進行成軟骨誘導(dǎo)分化，每3d進行換液，約21d后進行甲苯胺藍染色檢測。</p><p>　　①取甲苯胺藍0.5g，加蒸餾水定容至100ml；②取成軟骨誘導(dǎo)21d的細胞，吸去誘導(dǎo)液，再用PBS洗2-3遍；③加入10%中性甲醛，固定30-60min；④吸去固定液，加入0.5%的甲苯胺藍染色液，染色30min；⑤用PBS清洗兩次，去除殘留的染色液；⑥加入PBS，完成染色，于顯微鏡下觀察著

75、色情況（軟骨細胞可被染成藍色）。</p><p><b>　　結(jié) 果</b></p><p>　　1. PMSCs的體外培養(yǎng) </p><p>　　從胎盤分離得到的組織細胞，經(jīng)一周的培養(yǎng)后，可見單個散在存在的細胞呈梭形、多個細胞呈集落樣生長或與其它圓形、扁平形、多邊形等細胞混雜交織生長，梭形細胞生長較緩慢；經(jīng)過2-3次換液后，其他混雜的細胞

76、脫落，剩下形態(tài)比較均一的梭形細胞；培養(yǎng)至第15-20 天時，梭形細胞增殖加快，培養(yǎng)至25天左右，原代細胞可鋪滿瓶底80% 以上；經(jīng)傳代培養(yǎng)12 h后，細胞完全貼壁、伸展，呈長梭形（如圖1a）。</p><p>　　2. PMSCs三系誘導(dǎo)分化鑒定 </p><p>　　經(jīng)成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)10天后，細胞明顯呈現(xiàn)出脂肪細胞的形態(tài)，并且逐漸有脂肪滴的形成，用油紅（Oil Red）進行染色，油滴可

77、被染成紅色（如圖1b）；成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21天的細胞聚成多個團塊狀的個體，經(jīng)甲苯胺藍染色，可被染成藍色（如圖1c）；于6孔板中成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21天的細胞，肉眼可見許多結(jié)節(jié)狀物的散在存在，用茜素紅染液進行染色成骨部位被染成紫紅色，這些均與間充質(zhì)干細胞的特性相符。（如圖1d）。</p><p>　　a b</p><p>　　c

78、 d</p><p>　　圖1人胎盤源間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)及三系誘導(dǎo)分化（40×）</p><p>　?。╝正常培養(yǎng)的PMSCs；b成脂肪分化的油紅染色結(jié)果；c成軟骨分化的甲苯胺藍染色結(jié)果；d成骨分化的茜素紅染色結(jié)果）</p><p>　　3. PMSCs 的細胞表型分析鑒定 </p&g

79、t;<p>　　將所得細胞，用胰酶消化并收集，經(jīng)抗體標(biāo)記后，用流式細胞儀進行檢測分析，結(jié)果細胞表面分子CD73、CD90、CD105、CD166為陽性表達, CD34、CD45、CD116、HLA-DR為陰性（如圖2），這與一般對人間充質(zhì)干細胞的定義相一致[1]。</p><p>　　圖2 人胎盤源間充質(zhì)干細胞表面標(biāo)志檢測（3個不同胎盤檢測結(jié)果中較為代表性的一次，表示同型對照，表示檢測抗原）<

80、;/p><p><b>　　結(jié) 論</b></p><p>　　間充質(zhì)干細胞雖然早就被人們發(fā)現(xiàn)，但是直到近些年才受到廣泛關(guān)注，對于其定義，多是根據(jù)以往經(jīng)驗總結(jié)而來。我們根據(jù)06年細胞年會以及其他相關(guān)參考文獻[2-4]，從三個方面對其進行鑒定，確保了從胎盤中所獲得的細胞為間充質(zhì)干細胞。</p><p>　　首先，從細胞體外培養(yǎng)的形態(tài)特性來觀察，本研

81、究分離得到的細胞為長梭形，呈貼壁生長狀態(tài)，細胞密度高的時候呈旋渦狀；其次，通過流式細胞儀對細胞表面的標(biāo)志分子進行檢測，發(fā)現(xiàn)CD73[5]、CD90[6]、CD105 [7]、CD166[8]均為陽性表達，CD45、CD116、HLA-DR為陰性[8]，這與相關(guān)文獻報道是相一致的[9][10]，而CD34表達為陰性將其與造血干細胞區(qū)別開來；而且本研究還利用誘導(dǎo)劑使所得細胞向成脂肪、成骨、成軟骨細胞分化。綜合以上幾點，提示我們成功分離得到了

82、人胎盤間充質(zhì)干細胞。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1]Rasmusson I, Ringden O, Sundberg B, et al. Mesenchymal stem cells inhibit the formation of cytotoxic T lymphocytes, but not activated cyt

83、otoxic T lymphocytes or natural killer cells. Transplantation, 2003, 76: 1208–1213.</p><p>　　[2]Beyer Nardi N, da Silva Meirelles L. Mesenchymal stem cells: Isolation, in vitro expansi- on and characterizat

84、ion. Handb Exp Pharmacol, 2006, 174: 249–282.</p><p>　　[3]Sethe S,Scutt A,Stolzing A. Aging of mesenchymal stem cells. Ageing Res Rev, 2006, 5: 91–116.</p><p>　　[4]Dave L, Roelen,Barbara J.van

85、 der Mast, et al. Differential immunomodula- tory effects of fetal versus maternal multipotent stromal cells. Human Immunology, 2009, 70: 16–23.</p><p>　　[5]Barry F, Boynton R, Murphy M, et al. The SH-3 and

86、 SH-4 Antibodies Recognize Distinct Epitopes on CD73 from Human Mesenchymal Stem Cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2001, 289: 519-524.</p><p>　　[6]Barry FP, Boynton RE, Haynesworth

87、 S, et al. The monoclonal antibody SH-2, raised against human mesenchymal stem cells, recognizes an epitope on endoglin (CD105). Biochem.Biophys.Res.Commun, 1999, 265: 134-139.</p><p>　　[7]Dominici M, Le BK

88、, Mueller I et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 2006, 8: 315-317.</p><p>　　[8]Dean RJ.

89、 Moseley AB. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Experim Hematol, 2000, 28: 875-884.</p><p>　　[9]M Dominici1. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. Th

90、e International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 2006, 8: 315-317.</p><p>　　[10]Uccelli A, Moretta L, Pistoia V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol,

91、2008, 8: 726-736.</p><p>　　第二部分 PMSCs在體外誘導(dǎo)成骨分化過程中免疫原性的變化</p><p><b>　　材料與方法</b></p><p><b>　　（一）材料</b></p><p><b>　　1. 材料與儀器 </b></

92、p><p>　　二氧化碳培養(yǎng)箱（Sanyo公司，日本），離心機(TD5A-WS，湘儀公司，中國），倒置相差顯微鏡（IX71型， OLYMPUS 公司，日本），單人雙面超凈臺（SW-CJ-1F 型，蘇州凈化集團，中國），流式細胞儀（FC 500FCL，Beckman Coulter，美國），β液體閃爍計數(shù)儀（PrekinElmer公司，美國），微量移液槍（Eppendorf公司，德國），恒溫水浴鍋(HH-S2型，國立常

93、州實驗設(shè)備研究所，中國)，培養(yǎng)皿（D=9cm，Coming公司，中國），6、96孔細胞培養(yǎng)板（Coming公司，中國），15ml、50ml離心管（Coming公司，中國）。</p><p><b>　　2. 試劑</b></p><p>　　淋巴細胞分離液（Ficoll,比重1.077g/ml,上海試劑二廠，中國），ALP檢測試劑盒（南京建成生物，中國），鼠抗人CD2

94、8-FITC、CD80-PE、CD83-FITC、CD86-PE、MHCI-PE、MHCII-APC、PD L-1-FITC、B7DC-PE單克隆抗體(eBioscience公司，美國)，茜素紅染液（Gbico公司，美國），DMEM低糖培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國），胎牛血清（Hyclone公司，美國），L-抗壞血酸（Sigma公司，美國），地塞米松（Sigma公司，美國），β-磷酸甘油鈉（Sigma公司，美國），茜素紅染液（Sig

95、ma公司，美國），絲裂霉素（Sigma公司，美國），3H-TdR(北京原子能研究所，中國)。</p><p><b>　　（二）方法</b></p><p>　　1. PMSCs的成骨誘導(dǎo)分化和茜素紅染色檢測 </p><p>　　無菌條件下，取培養(yǎng)3代以后的細胞種于6孔板中，密度為5×104個/孔，待細胞完全貼壁后，吸去完全培養(yǎng)基

96、，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (DMEM、10%FBS、L-抗壞血酸 50μg/ml、β-磷酸甘油鈉 10mmol/ml、地塞米松 10-8mmol/ml)進行成骨細胞誘導(dǎo)分化，每3d進行半量換液，約20d進行茜素紅染色檢測。</p><p>　?、偃?.1g茜素紅，加蒸餾水定容至100ml，調(diào)整pH為7.5；②取成骨誘導(dǎo)21d的細胞，吸去誘導(dǎo)液，用PBS洗2-3遍；③加入10%中性甲醛，固定30-60min；④吸去固定

97、液，加入0.1%的茜素紅染色液，染色15-20min；⑤用PBS清洗兩次，去除殘留的染色液；⑥加入PBS，完成染色，于顯微鏡下觀察著色情況（茜素紅會和鈣發(fā)生顯色反應(yīng)，成骨誘導(dǎo)成功的細胞外面沉積的鈣結(jié)節(jié)會被染成深紅色）。</p><p>　　2. 流式細胞儀檢測細胞表面抗原 </p><p>　?、偃≌Ｅ囵B(yǎng)的PMSCs以及成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后的PMSCs，于無菌操作臺中，用0.025%胰蛋

98、白酶消化收集細胞，將細胞分裝于流式管中，調(diào)整細胞量為1×105個/管；</p><p>　?、?200rpm/min離心5分鐘，棄上清；</p><p>　?、蹖⒘魇焦苤糜诒希抗芗尤霟晒鈽?biāo)記的鼠抗人單克隆抗體1μl，避光孵育20-30 min，每5min輕輕搖晃流式管；</p><p>　　④每管加入含3%胎牛血清的PBS 800μl，1200rpm/

99、min離心清洗2遍，棄上清；</p><p>　?、菝抗芗尤?00μl PBS懸浮細胞，并用移液器輕輕吹打混勻，然后利用FC 500FCL流式細胞儀（Beckman Coulter）進行檢測，所得數(shù)據(jù)用FlowJo version 7.6.2 軟件進行處理分析。</p><p>　　3. T淋巴細胞的分離純化 </p><p>　　①收集3份健康志愿者肝素抗凝外周

100、血，用生理鹽水將抗凝血稀釋1倍。</p><p>　　②吸取2ml Ficoll（比重1.077g/ml）置于刻度離心管中，然后將離心管傾斜45°角，用毛細滴管將稀釋的全血沿管壁緩慢加至分離液上面，應(yīng)注意保持兩者界面清晰。</p><p>　?、墼?8℃～20℃下，用離心機以2000rpm/min離心20min。</p><p>　　④用吸管輕輕插到混濁帶

101、，沿管壁輕輕吸出此層細胞，移入另一支離心管中。即要吸取所有單個核細胞，又要避免吸取過多的分層液或血漿，以免混入其他細胞成分。</p><p>　?、萦肏anks液洗滌細胞3次，第一次2000rpm/min，10 min；第2～3 次1500rpm/min，10 min，可去掉大部分混雜的血小板。</p><p>　　⑥將收集得到的細胞懸液加到尼龍毛柱中，37℃，45min，回收所得T細胞純

102、度可達95%以上[1-6]。將沉淀細胞懸于培養(yǎng)基中備用。</p><p>　　4. T細胞增殖實驗</p><p>　　將正常培養(yǎng)的PMSCs以及成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后的PMSCs用絲裂霉素（10μg/ml）處理；細胞按1×104個/孔接種于96孔板中，然后每孔加入T細胞2×105個；實驗分為：T、T+PMSCs、T+PMSC-obs (成骨誘導(dǎo))、PMSCs、PMSC-o

103、bs (成骨誘導(dǎo))組；將細胞置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72h。在結(jié)束前18h的時候加入3H-TdR（1μCi/孔）；最后收集細胞，用β液體閃爍計數(shù)儀檢測cpm值，根據(jù)cpm值的大小，進行分析比較。</p><p>　　5. 細胞培養(yǎng)上清ALP活性檢測 </p><p>　　取干凈的15ml離心管，每個里面加入緩沖液和基質(zhì)液各0.5ml；然后于空白管中加入雙蒸水0.05ml，標(biāo)準(zhǔn)管中

104、加入0.1mg/ml酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液0.05ml，測定管中加入成骨誘導(dǎo)分化14d的細胞培養(yǎng)上清0.05ml，充分混勻，37℃水浴15min；然后每管加入顯色劑1.5ml，酶標(biāo)儀檢測測各組吸光度；利用下面的公式計算堿性磷酸酶的量：</p><p>　　6. 統(tǒng)計學(xué)分析 </p><p>　　所有計量資料用x±s表示t檢驗，計數(shù)資料用%表示χ2 檢驗，數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處