豆梨組織培養(yǎng)過程中玻璃化形成機(jī)制及其恢復(fù)技術(shù)研究.pdf

1、本文在建立了豆梨低玻璃化高效快繁技術(shù)的基礎(chǔ)上，針對引起試管苗玻璃化的影響因素進(jìn)行比較研究，從生理生化和分子角度分析豆梨試管苗玻璃化的形成機(jī)制，并對玻璃化苗恢復(fù)技術(shù)進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.建立豆梨低玻璃化高效快繁技術(shù)。以豆梨的莖段為外植體，研究6-BA、NAA、蔗糖、瓊脂、活性炭等因素對豆梨試管苗的影響，分析了4種基本培養(yǎng)基(MS、AS、NN69、WPM)，6-BA和NAA的不同濃度配比以及2種不同培養(yǎng)方式對豆梨

2、增殖效果的影響，還比較了NAA和IBA這2種激素對豆梨生根的影響。結(jié)果表明：在豆梨組織培養(yǎng)過程中，高濃度6-BA對豆梨增殖系數(shù)和玻璃化現(xiàn)象均有明顯的促進(jìn)作用，活性炭對增殖系數(shù)、玻璃化率及苗高起到抑制作用，高濃度NAA直接促進(jìn)莖的生長，以MS作為基本培養(yǎng)基，適宜增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA0.6 mg/L+NAA0.2mg/L，適宜培養(yǎng)方式為增殖培養(yǎng)基與MS空白培養(yǎng)基上隔代交替培養(yǎng)，適宜生根培養(yǎng)基為1/2 MS+1.5 mg/LIBA。

3、r>　　 2.研究了玻璃化試管苗的恢復(fù)技術(shù)。以正常增殖狀態(tài)下產(chǎn)生的玻璃化苗(輕度和重度)為材料，采取不同措施對玻璃化苗進(jìn)行恢復(fù)，并對玻璃化苗(輕度和重度)、恢復(fù)苗和正常苗在形態(tài)解剖學(xué)、生理生化、葉綠素?zé)晒獾确矫孢M(jìn)行比較研究。結(jié)果表明：對玻璃化苗(輕度和重度)進(jìn)行適當(dāng)?shù)乃挚刂坪妥贤饩€照射均能使兩種玻璃化苗有不同程度的恢復(fù)，其中將材料在無菌空三角瓶中封口放3天，使其適當(dāng)失水后，再將材料轉(zhuǎn)接到MS空白培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，最高恢復(fù)率可達(dá)10

4、0％。
　　 3.比較豆梨不同程度玻璃化苗和正常苗葉片超微結(jié)構(gòu)、葉綠素?zé)晒夂涂寡趸富钚圆町?。結(jié)果表明：(1)豆梨玻璃化苗葉片氣孔呈關(guān)閉狀態(tài)，細(xì)胞器受到損傷，葉綠體數(shù)量減少，類囊體膜排列紊亂。(2)玻璃化葉片比正常葉片有較低的Fv/Fm，F(xiàn)v/Fo，qP和PhiPS2，過剩的能量將在PSⅡ反應(yīng)中心積累，產(chǎn)生大量ROS。(3)正常苗的SOD、CAT酶活性均高于玻璃化苗，并且玻璃化程度越重，活性越低；POD酶活性則呈相反趨勢，表現(xiàn)為

5、正常苗低于玻璃化苗。
　　 4.利用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(Methylation-ensitive amplification poly-morphism，MSAP)技術(shù)分析豆梨正常苗和玻璃化苗CCGG位點(diǎn)胞嘧啶甲基化模式和水平的差異。結(jié)果表明：玻璃化苗總基因組DNA甲基化比率為83.3％，低于正常苗(87.6％)。此外，玻璃化苗去甲基化位點(diǎn)與葉片等組織衰亡有關(guān)，在DNA水平上，可能是葉片等組織衰老發(fā)育相關(guān)區(qū)域甲基化狀態(tài)的改變直