琯溪蜜柚汁胞粒化過程中生理變化與基因差異表達(dá)分析.pdf

1、琯溪蜜柚[Citrus grandis(L.) Osbeck cv. Guanxi-miyou]屬亞熱帶常綠喬木果樹，是我國(guó)最主要的栽培柚類品種。汁胞?；氰诸悾彩歉涕兕惼毡榘l(fā)生的一種生理病害，嚴(yán)重影響琯溪蜜柚的食用品質(zhì)和商品價(jià)值。因此，汁胞?；虻难芯砍蔀楝g溪蜜柚生產(chǎn)的關(guān)鍵問題。本文通過對(duì)琯溪蜜柚果實(shí)成熟過程中汁胞?；c活性氧代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、礦物質(zhì)、內(nèi)源激素關(guān)系的研究，琯溪蜜柚汁胞mRNA差異顯示實(shí)驗(yàn)體系的建立和差異片段的獲得，采

2、用RACE技術(shù)，克隆汁胞發(fā)育(正常發(fā)育與?；?相關(guān)基因的cDNA全長(zhǎng)，探討了琯溪蜜柚果實(shí)汁胞粒化過程中的生理生化變化，并為從分子水平上闡明琯溪蜜柚汁胞?；臋C(jī)制奠定基礎(chǔ)。取得的主要研究結(jié)果如下。 1、以易發(fā)生汁胞?；睦淆g樹和不易發(fā)生汁胞粒化的適齡樹的琯溪蜜柚果實(shí)為材料，探討琯溪蜜柚果實(shí)成熟過程中汁胞粒化與活性氧代謝的關(guān)系。研究果實(shí)成熟過程中汁胞MDA、H2O2、木質(zhì)素含量，活性氧清除酶(POD、SOD、CAT)活性和內(nèi)源抗氧化

3、物質(zhì)(AsA、GSH)含量的變化。與不易發(fā)生?；倪m齡樹果實(shí)相比，易發(fā)生汁胞?；睦淆g樹果實(shí)汁胞成熟過程中，汁胞?；笖?shù)，H2O2、MDA和木質(zhì)素含量增加，AsA和GSH含量減少，SOD活性前期減少后期增加，CAT活性增加，POD活性顯著增加?，g溪蜜柚果實(shí)成熟過程中，活性氧代謝失調(diào)導(dǎo)致活性氧(H2O2)積累和POD活性的增強(qiáng)而促進(jìn)木質(zhì)素的合成，從而導(dǎo)致汁胞?；陌l(fā)生。 2、通過石蠟切片對(duì)琯溪蜜柚果實(shí)(10月8日)粒化和未?；?/p>

4、的觀測(cè)表明，?；野b腫、囊壁角質(zhì)增生、細(xì)胞層增加、細(xì)胞壁增厚，細(xì)胞壁的次生內(nèi)鑲物和復(fù)飾物的木質(zhì)化程度增加，出現(xiàn)汁胞?；F(xiàn)象。 3、以易發(fā)生汁胞?；睦淆g樹和不易發(fā)生汁胞粒化的適齡樹的琯溪蜜柚果實(shí)為材料，探討琯溪蜜柚果實(shí)成熟過程中汁胞礦質(zhì)元素的變化。在琯溪蜜柚汁胞?；^程中，N、K含量維持較高水平：與未?；啾?，?；鸑、P、Zn、 Mg、 Ni、Cu含量較高，而Ca含量較低。 4、以易發(fā)生汁胞?；睦淆g樹和不

5、易發(fā)生汁胞?；倪m齡樹的琯溪蜜柚果實(shí)為材料，探討琯溪蜜柚果實(shí)成熟過程中汁胞內(nèi)源激素的變化。琯溪蜜柚由于自花不親和，其自然單性結(jié)實(shí)果實(shí)為無核果實(shí)，在果實(shí)?；^程中內(nèi)源激素的不均衡分布，尤其是在?；饎?dòng)和加快階段果實(shí)汁胞中IAA、GA3、ZR濃度偏低和ABA濃度偏高，以及GA3、ZR和ABA各自之間比例的改變引起的內(nèi)源激素失衡是導(dǎo)致粒化的原因之一。 5、以琯溪蜜柚老齡樹(母樹)不同?；A段果實(shí)的未?；土；麨椴牧?，建立mRNA差

6、別顯示技術(shù)體系，包括汁胞總RNA提取方法、DDRT-PCR體系的優(yōu)化。應(yīng)用改良CTAB法提取琯溪蜜柚汁胞的RNA，獲得的RNA質(zhì)量高。篩選了DDRT-PCR體系中各反應(yīng)因素的濃度，優(yōu)化后20μL體系各組分濃度為：cDNA第一鏈產(chǎn)物2μL(RT反應(yīng)體系中總RNA的用量為2μg)、dNTPmix濃度為40μM、單引物濃度為0.4μmol·L-1和Taq DNA聚合酶用量為0.2 U。該反應(yīng)體系的產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，可以獲得數(shù)量適宜、條帶清晰、重

7、復(fù)性好的cDNA片段。 6、用9條錨定引物與20條隨機(jī)引物組成了引物對(duì)180個(gè)，對(duì)供試琯溪蜜柚未?；土；M(jìn)行了反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，應(yīng)用mRNA差異顯示技術(shù)研究琯溪蜜柚汁胞粒化過程中未?；土；虻谋磉_(dá)，獲得了差異cDNA片段25個(gè)，回收cDNA差異片段并進(jìn)行克隆、測(cè)序及同源性比較分析。得到與?；嘘P(guān)基因差異表達(dá)的cDNA片段7個(gè)，與未粒化有關(guān)基因差異表達(dá)的cDNA片段9個(gè)。Miyou1、Miyou2、Miyou7、

8、Miyou8、Miyou17等5個(gè)片段已在GenBank中登錄，登錄號(hào)分別為：FJ866625、FJ866626、FJ866629、FJ866627、FJ866628，抽取部分差異片段經(jīng)反Northern雜交獲得2條陽性片段。 7、首次采用RACE技術(shù)，克隆琯溪蜜柚汁胞發(fā)育(未粒化與?；?相關(guān)基因的cDNA全長(zhǎng)，根據(jù)與?；嘘P(guān)的Miyou22 cDNA片段設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行保守區(qū)和5' RACE的克隆，通過序列拼接得到了cDNA全長(zhǎng)

9、序列，登錄號(hào)為FJ866630；序列分析表明得到的cDNA全長(zhǎng)共1602 bp，其中，5'UTR為142 bp，3'UTR為204 bp，3'UTR區(qū)域還含有典型的加尾信號(hào)AATAA和poly(A)尾；開放閱讀框(ORF)共有1254個(gè)堿基組成，編碼418個(gè)氨基酸。將序列經(jīng)過BLAST比較，該序列與翻譯延伸因子1-γ高度同源，其中，與煙草、水稻的翻譯延伸因子1-γ的同源性分別是81.3％、79％。翻譯延伸因子與蛋白質(zhì)合成延伸有關(guān)。

10、 8、根據(jù)汁胞未?；虿町恈DNA片段Miyou1設(shè)計(jì)引物，采用RACE技術(shù)克隆了該片段5’端全長(zhǎng)序列，將獲得的5’端cDNA與Miyou1差異片段拼接，拼接后得到Miyou1全長(zhǎng)序列，其大小為1152 bp，包含1個(gè)819 bp的開放閱讀框架，編碼272個(gè)氨基酸。其中，5'UTR為77 bp，3'UTR為244 bp，3'UTR區(qū)域還含有poly(A)尾。登錄號(hào)為FJ866624。進(jìn)一步的Blast分析顯示，該cDNA全長(zhǎng)序列與2