中藥“連黃”對巴氏桿菌耐藥基因strA、SulⅡ影響的研究.pdf

1、巴氏桿菌病主要是由特定血清型的多殺性巴氏桿菌引起畜禽共患的一種烈性傳染病。且發(fā)病率和死亡率很高，常給養(yǎng)殖業(yè)造成較為嚴(yán)重的損失。為此臨床上大量使用抗菌藥物來控制本病，致使巴氏桿菌耐藥性普遍存在,特別是高耐藥菌株的出現(xiàn)，導(dǎo)致多數(shù)藥物對耐藥菌的臨床療效降低或無效。為此，我們針對其對鏈霉素和磺胺類藥物具有極高耐藥性這一特點，對中藥“連黃”消除巴氏桿菌對鏈霉素及磺胺類藥物的耐藥性進(jìn)行研究并從分子生物學(xué)水平上對中藥“連黃”對巴氏桿菌耐藥基因SulⅡ

2、和strA影響的機理進(jìn)行初步探討。
　　本試驗應(yīng)用體外培養(yǎng)試驗來初步研究中藥“連黃”對耐藥巴氏桿菌的磺胺、氨基糖苷類藥物耐藥性的抑制作用。通過瓊脂平板點種培養(yǎng)法檢測亞抑菌濃度中藥“連黃”對巴氏桿菌的磺胺、氨基糖苷類藥物的耐藥性抑制率，同時將中藥“連黃”對巴氏桿菌菌株的耐藥抑制率分別與敏感巴氏桿菌進(jìn)行比較，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，判斷耐藥性抑制劑的作用效果。
　　根據(jù)巴氏桿菌鏈霉素耐藥基因StrA和磺胺耐藥基因Su1II序列設(shè)計合成2對

3、引物，以臨床分離的禽源巴氏桿菌耐藥菌株質(zhì)粒DNA為模板，通過PCR技術(shù)，擴增出巴氏桿菌StrA、Su1II基因片段。將長約1136bp的StrA目的基因和796bp的Su1II目的基因克隆到 pMD-18T載體上進(jìn)行克隆測序。對中藥作用前后實驗用巴氏桿菌（P0、P1、DH01、DL01、P2）的耐藥基因進(jìn)行對比分析，檢測中藥“連黃”對巴氏桿菌的耐藥基因 StrA、Su1II的影響，初步探討中藥“連黃”降低巴氏桿菌對磺胺、氨基糖苷類藥物耐

4、藥性的作用機制。
　　結(jié)果：由瓊脂平板點種法結(jié)果可知，亞抑菌濃度中藥“連黃”對耐藥巴氏桿菌P1、DL01、DH01的抑制率與敏感菌P0比較差異不顯著，阿米卡星對耐藥巴氏桿菌DL01、P2的抑制率與敏感菌P0比較差異顯著，鏈霉素對耐藥巴氏桿菌P2的抑制率與P0比較差異極顯著。由藥敏紙片法結(jié)果可知，經(jīng)中藥“連黃”亞抑菌濃度作用后，各抗生素對耐藥巴氏桿菌P1、DL01、DH01的抑菌環(huán)大小與敏感菌P0比較差異不顯著，磺胺對P2的抑菌環(huán)大

5、小與P0比較差異顯著，鏈霉素和阿米卡星對P2的抑菌環(huán)大小與P0比較差異極顯著；且阿米卡星對DL01的抑菌環(huán)大小與P0比較差異顯著。通過克隆測序耐藥巴氏桿菌StrA（P1）基因序列與GenBank中發(fā)表序列（NC_001774）同源性為99.7％，StrA（DL01）基因序列與GenBank中發(fā)表序列（NC_001774）同源性為99.0%其StrA基因序列中有2個堿基發(fā)生突變，即204C→G,686T→C。同過克隆測序耐藥巴氏桿菌P1的

6、Su1Ⅱ基因與GenBank中發(fā)表序列（NC_001774）同源性達(dá)到99.5％，DH01的Su1Ⅱ基因與GenBank中發(fā)表序列（NC_001774）同源性達(dá)到98.7%。中藥作用前后的巴氏桿菌Su1Ⅱ基因在580～600堿基區(qū)域內(nèi)有所改變，但其相應(yīng)的氨基酸并沒有發(fā)生變化。
　　結(jié)論：中藥“連黃”亞抑菌濃度可有效的降低巴氏桿菌對磺胺、鏈霉素的耐藥性；其作用機制是由于改變了其耐藥基因StrA、Su1Ⅱ的部分堿基，從而使耐藥基因失活