大蔥葉槲皮素的提取工藝及設計

1、<p>　　本科生畢業(yè)論文（設計）</p><p>　　中 文 題 目 大蔥葉槲皮素提取工藝及設計 </p><p>　　英文題目 Extraction and Design of Quercetin from Welsh Onion Leaf </p><p

2、>　　學生姓名 孫夢涵 班級 450904 學號 45090422 </p><p>　　學 院 生物與農(nóng)業(yè)工程學院 </p><p>　　專 業(yè) 食品科學與工程 </p><p>　　指導教師 徐艷陽 職稱 副教授 &l

3、t;/p><p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　第1章 緒論8</b></p><p><b>　　1.1 前言8</b></p><p>　　1.1.1 大蔥的概述8</p><p>　　1.1.2 槲皮素的概述8&l

4、t;/p><p>　　1.2 槲皮素的提取方法研究現(xiàn)狀9</p><p>　　1.2.1 浸漬提取法9</p><p>　　1.2.2 堿提取法10</p><p>　　1.2.3 有機溶劑回流法10</p><p>　　1.2.4 全自動加壓溶劑萃取法10</p><p>　　1

5、.2.5 酶提取法11</p><p>　　1.2.6 超聲提取法11</p><p>　　1.2.7 微波提取法12</p><p>　　1.3 槲皮素測定方法研究現(xiàn)狀12</p><p>　　1.3.1 分光光度法12</p><p>　　1.3.2 高效液相色譜法13</p>

6、<p>　　1.3.3 動力學分析法13</p><p>　　1.4 槲皮素的生物活性13</p><p>　　1.4.1 槲皮素的抗氧化性13</p><p>　　1.4.2 槲皮素的抗腫瘤作用14</p><p>　　1.4.3 槲皮素的消炎作用14</p><p>　　1.5 本研究的

7、意義和主要內(nèi)容15</p><p>　　1.5.1 本研究的意義15</p><p>　　1.5.2 本研究的主要內(nèi)容15</p><p>　　第2章 大蔥蔥葉中槲皮素的提取工藝研究16</p><p><b>　　2.1 引言16</b></p><p>　　2.2 試驗材料、試

8、劑與儀器16</p><p>　　2.2.1 試驗材料與試劑16</p><p>　　2.2.2 試驗儀器與設備16</p><p>　　2.3 試驗方法16</p><p>　　2.3.1超聲輔助提取法提取大蔥蔥葉中槲皮素的方法16</p><p>　　2.3.2槲皮素化合物的測定16</p>

9、<p>　　2.4 單因素試驗18</p><p>　　2.4.1 乙醇濃度對槲皮素提取率的影響18</p><p>　　2.4.2 固液比對槲皮素提取率的影響18</p><p>　　2.4.3 超聲時間對槲皮素提取率的影響18</p><p>　　2.4.4 超聲溫度對槲皮素提取率的影響18</p>

10、<p>　　2.4.5 超聲功率對槲皮素提取率的影響18</p><p>　　2.5工藝參數(shù)優(yōu)化19</p><p>　　2.5.1設計方法19</p><p>　　2.5.2響應曲面優(yōu)化法19</p><p>　　2.6 結果與分析19</p><p>　　2.6.1 檢測波長的選擇20<

11、/p><p>　　2.6.2 標準曲線的繪制20</p><p>　　2.6.3 單因素試驗的顯著性分析方法21</p><p>　　2.6.4 大蔥葉槲皮素提取單因素試驗結果分析22</p><p>　　2.6.5 響應面優(yōu)化試驗的結果分析30</p><p>　　2.6.6 最佳工藝條件的預測與檢驗33<

12、;/p><p>　　2.7 本章小結33</p><p>　　第3章 大蔥葉提取物清除亞硝酸鹽效果的研究35</p><p><b>　　3.1 引言35</b></p><p>　　3.2 試驗材料、試劑與儀器35</p><p>　　3.2.1試驗材料與試劑35</p>

13、<p>　　3.2.2試驗儀器與設備35</p><p><b>　　3.3 原理35</b></p><p>　　3.4 試驗方法35</p><p>　　3.4.1試劑的配制35</p><p>　　3.4.2試驗步驟36</p><p>　　3.5結果與討論37<

14、/p><p>　　第4章 結論39</p><p><b>　　致謝40</b></p><p><b>　　參考文獻41</b></p><p><b>　　中文摘要</b></p><p>　　槲皮素廣泛分布于植物界中，是藥用植物的有效成分之一，

15、在臨床上已被證明具有多種生物活性，如抗癌、抗氧化、抑菌等，而且毒副作用較小。目前，從各種植物中提取槲皮素的研究很多，且主要集中于從洋蔥和槐米中提取，只有劉維信等嘗試從大蔥蔥白中提取槲皮素，從大蔥葉中提取槲皮素的研究還近乎空白。因此，本文選取大蔥葉，進行槲皮素提取，以期為大蔥葉的深加工提供工藝參數(shù)和理論依據(jù)。</p><p>　　主要研究內(nèi)容與結果如下：</p><p>　?。?）通過單因素

16、試驗，研究了從大蔥葉中超聲提取槲皮素的工藝，確定了槲皮素提取的超聲溫度為50℃、超聲功率為200W，同時選擇提取時間25～45min，乙醇濃度70%～90%，固液比1:70～1:90進行后續(xù)響應曲面優(yōu)化試驗。</p><p>　　在三因素三水平響應曲面優(yōu)化試驗中，以大蔥葉中槲皮素提取率為響應值Y（mg/g）,經(jīng)二次回歸擬合求得回歸方程：Y=6.96-0.23A-0.19B+0.18C+0.027AB+0.20AC

17、+0.12BC-0.35A2-0.30B2+0.15C2</p><p>　　此模型的擬合度為0.8847，可以反映出槲皮素提取率隨各參數(shù)變化的規(guī)律。同時得到大蔥葉槲皮素最佳提取條件為提取時間35min、乙醇濃度78%、固液比1:90，經(jīng)驗證試驗得出結果是：大蔥葉中槲皮素的提取率為(7.17±0.087)mg/g，實際值與理論值間的相對誤差為1.81%。</p><p>　?。?

18、）大蔥葉提取液與抗壞血酸溶液相比，抗壞血酸對亞硝酸鹽的清除能力比較強，當抗壞血酸溶液達到濃度0.10mg/mL時，亞硝酸鹽清除率達到最大89.64%，若抗壞血酸溶液濃度繼續(xù)增大，亞硝酸鹽清除率趨于穩(wěn)定；而大蔥葉提取液濃度為0.14mg/mL時，亞硝酸鹽清除率達到最大值83.82%。</p><p>　　關鍵詞：大蔥葉 槲皮素 超聲提取 亞硝酸鹽 清除</p><p><b>　　

19、ABSTRACT</b></p><p>　　Quercetin is widely distributed in the plant kingdom, which is one of the effective constituents of medicinal plants. It has been clinically proved to possess a variety of biologi

20、cal activity, such as anticancer, antioxidant, antibacterial, and the side effects is small. At present, there are a lot of researches to extract quercetin from all kinds of plants, and mainly focus on extraction from on

21、ion and Flos sophorae. Only Liu Weixin attempts to extract quercetin from the Welsh onion stalk, and </p><p>　　The main research contents and results are as follow:</p><p>　　(1) The single facto

22、r experiment has studied on the ultrasonic extraction process of quercetin from Welsh onion leaf. The process parameters were as follow: ultrasonic temperature 50℃, ultrasonic power 200W, and at the same time, extraction

23、 time 25 ~ 45min, ethanol concentration 70% ~ 90%, solid-liquid ratio 1:70～1:90 for subsequent response surface optimization test.</p><p>　　In the response surface optimization experiment(3 factors and 3 lev

24、els), the extraction rate of quercetin from Welsh onion leaf was selected as response value: Y(mg/g). The regression equation was obtained through two times of regression:</p><p>　　Y=6.96-0.23A-0.19B+0.18C+0

25、.027AB+0.20AC+0.12BC-0.35A2-0.30B2+0.15C2</p><p>　　The model fitting degree was 0.8847, which can truly reflect that the quercetin extraction rate varied with the the law of parameters. At the same time, the

26、 optimal extraction conditions of quercetin from Welsh onion leaf were extraction time 35min, ethanol concentration78%, solid-liquid ratio 1:90. The test result was (7.17 ± 0.087) mg/g, and the relative error betwee

27、n the actual value and the theoretical value was 1.81%.</p><p>　　(2) When Welsh onion leaf extract and ascorbic acid solution were compared, the nitrite scavenging ability of ascorbic acid solution was stron

28、ger. When ascorbic acid solution reached the concentration of 0.10mg/mL, its scavenging effect reached the maximum 89.64%. If concentration continued to increase, scavenging effect maintained on maximal value. While the

29、Welsh onion leaf extract concentration was 0.14mg/mL, the nitrite scavenging rate reached maximum value 83.82%. </p><p>　　Keywords: Welsh onion leaf quercetin ultrasonic extraction nitrite scavenging<

30、/p><p><b>　　第1章 緒論</b></p><p><b>　　1.1 前言：</b></p><p>　　隨著經(jīng)濟技術的發(fā)展，人們對于飲食的要求已不僅局限于飽腹或是單純地滿足口味，而是對食品的保健要求越來越高，由于這種市場需求的增強，研究領域正在掀起研究保健類食品的熱潮。隨著研究的不斷深化，大蔥的保健功能逐漸被

31、人們所熟知，大蔥不僅可發(fā)表通陽，用于治療風寒感冒、惡寒發(fā)熱、頭痛鼻塞，還有強健脾胃的功能，常食大蔥也能降低患膽固醇、癌癥等疾病的風險。同時，大蔥中所含槲皮素也具有良好的保健價值，由于槲皮素結構中富含酚羥基,故具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗癌變等多種生理功能，因此從大蔥中提取槲皮素具有重要意義。 </p><p>　　1.1.1 大蔥的概述</p><p>　　大蔥（Allium fistul

32、osum L.）又名蔥、和事草，百合科（Liliaceae）蔥屬(Allium)2～3年生草本植物，是中國北方地區(qū)重要的蔬菜之一，其栽培面積居第三位。大蔥微辛、性微溫，含有揮發(fā)油，油中主要成分為蒜素，這種物質(zhì)有較強的殺菌作用，不僅可以延長其自身的貯藏期，對人體而言，還能有效抑制痢疾桿菌及皮膚真菌，另外，大蔥還含有脂肪、糖類、胡蘿卜素、維生素B、C、煙酸、鈣、鎂、鐵等成分。大蔥產(chǎn)量高、栽培容易、耐儲存，是一種很受歡迎的蔬菜和調(diào)味品，它同時

33、有著強身健體和保健作用，可發(fā)表通陽，用于治療風寒感冒，惡寒發(fā)熱，頭痛鼻塞，陰寒腹痛，痢疾泄瀉，蟲積內(nèi)阻，乳汁不通，二便不利等。經(jīng)國外科學家研究，大蔥能促進消化液的分泌，還有強健脾胃的功能，常食大蔥也能降低患膽固醇疾病的風險，對癌癥的抑制也有顯著的效果。</p><p>　　由于大蔥有易栽培、高產(chǎn)量、耐儲存的優(yōu)點，常常出現(xiàn)供過于求的局面，故而若成功開發(fā)出大蔥的新型加工方法，不僅可提高其經(jīng)濟價值，又可合理調(diào)配，減少浪

34、費。</p><p>　　1.1.2 槲皮素的概述</p><p>　　槲皮素（quercetin），又名櫟精，分子式為C15H10O7，相對分子質(zhì)量為302.23，是一種呈黃綠色粉末狀的黃酮類化合物，具有多種生物學活性，化學名稱為3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮，在95～97℃變?yōu)闊o水物，在314℃分解，幾乎不溶于水[1]，可溶于乙醇、甲醇、乙酸乙酯等，許多植物的花、葉、果實中都含有槲

35、皮素，洋蔥中的含量尤多，在植物的生長、發(fā)育、開花、結果以及抗菌防病等方面起著重要的作用[2]，槲皮素分子結構見圖1-1。</p><p>　　圖1-1 槲皮素分子結構圖</p><p>　　Fig.1-1 Molecular structure of quercetin</p><p>　　研究表明，大蔥中含有黃酮一類化合物，其中槲皮素含量較多，槲皮素對人體保健方面

36、有重要意義。由于槲皮素中富含酚羥基,故具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗癌變等多種生理功能,而其抗氧化的性質(zhì)又可起到抗衰老、抗突變、抗動脈粥樣硬化等功能，近年來，抗氧化和抗腫瘤成為研究的熱點[3-6]，受到普遍關注。</p><p>　　1.2 槲皮素提取方法的研究現(xiàn)狀</p><p>　　學者逐漸意識到槲皮素對于人體的益處，故而對槲皮素提取的研究正在逐漸深化，目前槲皮素主要從洋蔥和槐米中提取

37、，雖然大蔥中也含有含量較高的槲皮素，但從大蔥中提取槲皮素的相關報道較少。</p><p>　　槲皮素的主要提取方法：根據(jù)前人的試驗發(fā)現(xiàn)，槲皮素的提取方法主要包括浸漬提取法、堿提取法、回流法、全自動加壓溶劑萃取法、酶提取法、超聲提取法、微波提取法等，其中，自動加壓溶劑萃取法、酶提取法、超聲提取法、微波提取法是近年來新興的方法。</p><p>　　1.2.1 浸漬提取法　</p>

38、<p>　　浸漬提取法操作簡單，即選用適當?shù)娜軇μ崛∥镞M行浸泡，使有效物質(zhì)溶出的方法。由于其效率低效果差，很少單獨用來提取化合物。劉世民[7]對洋蔥中黃酮類物質(zhì)的水提取進行了研究，他以浸提水用量、浸提時間和浸提溫度為因素進行了正交試驗，認為當固液比1:3，浸提時間40min，浸提水溫為90℃時，浸提效果最好。浸漬提取法由于試驗條件容易控制、操作簡單、成本低廉的優(yōu)點，偶爾被用來提取某些特殊的化合物。</p>

39、<p>　　1.2.2 堿提取法　</p><p>　　堿提取法的原理是，槲皮素有4個酚羥基，呈現(xiàn)一定酸性，故其具有易溶于堿液而難溶于酸液的特點，因此可利用堿溶液可使植物中的槲皮素溶出，之后向溶液中添加酸性物質(zhì)來降低槲皮素的溶解度，進而使之結晶析出來獲得槲皮素提取物。全先高[8]等比較了了從槐米中提取蘆丁的方法，分別采用水提取法、堿提取酸沉淀法和堿提取酸沉淀加抗氧化劑法，試驗結果表明，水提取法提取物純

40、度高但效率低，堿提取酸沉淀法效率提高但純度稍低，經(jīng)分析認為是在提取過程中蘆丁與堿發(fā)生了反應，故加入一定亞硫酸鈉抗氧化劑可以減少蘆丁氧化分解，提高純度。</p><p>　　1.2.3 有機溶劑回流法　</p><p>　　回流法指用有機溶劑提取目標物的有效成分，浸提液被加熱，并不斷流出再流入浸提器，直至有效成分被充分提取，該法浸提時間較長，常與微波法、超聲法結合使用，可以提高其提取效率。王

41、文清等[9]對比了超聲提取法、回流法和浸漬提取法提取細梗胡枝子中槲皮素與蘆丁，試驗表明，以70%乙醇為提取劑的回流法提取效果最好，將2g樣品加入30mL乙醇中，加熱回流1h，可提取槲皮素和蘆丁分別為5.39μg·g-1和37.53μg·g-1。</p><p>　　1.2.4 全自動加壓溶劑萃取法</p><p>　　全自動加壓溶劑萃取法是對有機溶劑回流法的改進，同樣是

42、利用有機溶劑進行萃取，只是使用了全自動加壓溶劑萃取儀，在預先設定的高溫高壓條件下自動完成萃取過程，此法克服了普通有機溶劑回流法操作繁瑣、效率低、溶劑消耗量大的缺點，大大提高了萃取效率和效果，同時具有較高的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。劉新艷等[10]應用此法測定洋蔥中蘆丁和槲皮素的含量，經(jīng)過石油醚去脂除雜的過程，使用甲醇提取黃酮類物質(zhì)，在壓力為10MPa，溫度為120℃的條件下，萃取10分鐘即可，隨后利用高效液相色譜進行測定，她認為此法可作為蔬菜和水

43、果中黃酮類物質(zhì)快速測定的有效方法。</p><p>　　1.2.5 酶提取法</p><p>　　由于受到植物細胞壁的阻礙，使用浸漬提取法和有機溶劑回流法從大蔥中提取槲皮素效果常常不夠理想，基于這一點，可以利用酶的專一性，使用相應的酶對植物細胞壁得以破壞，使目標提取物更易溶出。在酶法基礎上再恰當?shù)厥褂媒n提取法或有機溶劑回流法等，提取效果可被明顯優(yōu)化。汪元元等[11]就利用上述方法，選擇

44、纖維素酶與洋蔥作用1h后，再用乙醇提取1h，研究了酶解pH、酶濃度、乙醇濃度及酶解溫度對槲皮素提取率的影響，認為當酶解pH5.5，酶解濃度0.5mg/mL，酶解溫度45℃，酶解時間1.5h、乙醇濃度70%時，槲皮素的提取效果最好，平均提取率可達0.046%。</p><p>　　1.2.6微波提取法　</p><p>　　微波提取法原理是，高頻電磁波有很強的穿透力，可以加速物質(zhì)中分子的運動

45、，從而使被提取物細胞內(nèi)的溫度升高，又由于各物質(zhì)吸收微波的能力存在差異,被提取物中某些成分被明顯地選擇性加熱,進而被選擇性地提取出來。該方法是近年來比較熱門的提取方法之一，王榮[12]等利用微波提取法對積雪草中總黃酮提取工藝進行了確定，認為當重復提取次數(shù)為3次、微波輻射時間20s、積雪草粉與甲醛比例為1:10且微波功率為480W時，提取效果最優(yōu)。金艷梅等[13]比較了堿提取法、乙醇回流法及微波提取法提取紫花地丁中黃酮化合物的效果，認為微波

46、提取法提取效果最好，并對該種方法的提取條件進行了優(yōu)化，得到微波功率為1300W，乙醇濃度為65%、提取時間為20s、物料與乙醇之比為1:15時，提取效果最佳。</p><p>　　1.2.7超聲提取法　</p><p>　　超聲波通過振動可以產(chǎn)生能量，從而引起共振，這種共振會為提取物提供強大的加速度，進而產(chǎn)生空化作用，這種空化作用具有很強的破壞力，同時可加速溶解，從而使提取物中的目標成分被

47、有效提取出。除空化效應外，熱效應及機械作用也起著輔助作用，在這些物理效應的共同作用下，提取變得更加快捷、安全、可靠。孫媛媛[14]分別采用有機溶劑浸漬法、有機溶劑回流法、超高壓、超聲四種提取法提取丁香葉中槲皮素，最終得到的結論是超高壓及超聲輔助提取法較傳統(tǒng)提取方式有較大優(yōu)勢，特別是超聲提取法，當甲醇與25%鹽酸體積比為3:1，固液比為40:1，提取時間為30min并提取3次時，槲皮素提取率可達到8.6mg/g。張仁堂[15]等利用超聲輔

48、助提取法提取洋蔥皮中黃酮類物質(zhì)，最終優(yōu)化工藝參數(shù)為固液比 1:10，乙醇濃度80%，超聲時間20min，此時提取率已到達理論值的 0.83%。</p><p>　　1.3 槲皮素測定方法研究現(xiàn)狀</p><p>　　根據(jù)前人的試驗發(fā)現(xiàn)，槲皮素的測定方法主要包括分光光度法、高效液相色譜法及動力學分析法。</p><p>　　1.3.1 分光光度法</p>

49、<p>　　分光光度法是利用朗伯比爾定律對某一物質(zhì)的濃度進行測定的方法，即通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)對光的吸收度或其自身的發(fā)光強度，對該物質(zhì)進行分析的方法。試驗者可配制一系列濃度的標準溶液，在特定波長分別測定其吸光度，并繪制標準曲線。將待測溶液在相同波長下測定其吸光度，根據(jù)標準曲線可得知其濃度。該法操作簡便、快速、靈敏度高、準確度高、適用性廣，因此得以廣泛應用，大多無機離子和許多有機化合物都可以直接或間接地

50、用該法進行測定。此法在測定槲皮素方面應用也較為廣泛，劉維信[16]等應用此法測定了大蔥槲皮素含量，回瑞華[17]等在洋蔥黃酮提取液中加入鐵鹽，生成穩(wěn)定的配合物，使黃酮的吸光帶由240～280nm轉移至457nm，以避開洋蔥中苯丙素酚類化合物、甾體、皂甙類化合物的影響。</p><p>　　1.3.2 高效液相色譜法</p><p>　　高效液相色譜法是一種新興的測定方法，具有測量迅速、數(shù)值

51、準確、重現(xiàn)度高的優(yōu)點，可是其設備昂貴，使用受到一定的限制。但有關高效液相色譜法測定槲皮素的提取量已經(jīng)成為一種趨勢，研究者非常關注這種前沿的測定方法，此方法的使用也正逐漸趨于成熟。高效液相色譜法克服了分光光度法干擾多、誤差大的缺點，在有高精密度要求的試驗中備受青睞[18]。</p><p>　　1.3.3 動力學分析法</p><p>　　動力學分析法的原理是，由于化學反應的速率與反應物的

52、濃度或催化劑有關，從而可以通過測量反應的速率以確定待測物的含量。由于測量的對象是含量較高的其他物質(zhì)，而非微量的催化劑自身，故此法的靈敏度很高。楊慧仙[19]等研究了催化動力學熒光法測定洋蔥中槲皮素的具體方法，認為槲皮素的檢出限為0.13μg·L-1,其質(zhì)量濃度在0.43～18.0μg·L-1范圍內(nèi), 熒光強度改變值(ΔIF)與槲皮素濃度呈線性關系,回歸方程為ΔIF= 31.64ρ(μg·L-1)-17.28

53、，相關系數(shù)為0·9967。</p><p>　　1.4 槲皮素的生物活性</p><p>　　1.4.1 槲皮素的抗氧化性</p><p>　　在抗氧化方面槲皮素具有清除活性氧自由基的能力，抗氧化和清除活性自由基這兩種作用密切相關[20]，槲皮素尤其能較好的清除超氧陰離子(O2-),羥自由基(·OH)和單線態(tài)氧(1O2)，還可降低脂質(zhì)氧化速率，由

54、于槲皮素能夠清除自由基，便能夠減少自由基對膜的攻擊，這種攻擊常常造成膜的脂質(zhì)過氧化分解，一旦這種損害得以降低，便可延緩人體衰老。同時，當某些金屬離子與槲皮素化合后，所形成的螯合物擁有超過槲皮素的抗氧化能力。 Milanea[21]認為，黃酮類物質(zhì)在堿性條件下能較好地清除自由基，槲皮素具有一、二、三鈉鹽，通過試驗得到結論，在pH為7.4條件下，槲皮素二鈉鹽有最強的清除自由基的能力。</p><p>　　1

55、.4.2 槲皮素的抗腫瘤作用</p><p>　　在抗腫瘤方面，槲皮素有抑制腫瘤細胞增殖的作用，即促使T細胞增殖，使癌細胞分裂減慢[22]，還可以通過抑制蛋白酪氨酸激酶和蛋白激酶C來抑制癌細胞的繁殖[23]。 </p><p>　　槲皮素可逆轉腫瘤細胞耐藥性，可以作為癌細胞耐藥性的調(diào)節(jié)體使用[24]。槲皮素可通過提高腫瘤細胞對藥物的敏感性以延長其敏感周期，增強藥物效果；還可以使藥物在體內(nèi)長

56、期保持一定濃度，提高藥物的針對性及正常組織對藥物副作用的抵抗力，故而槲皮素在抗腫瘤方面表現(xiàn)出較好的效果[6]。</p><p>　　日常食用黃酮類物質(zhì)，可有效地防止化學誘導的癌癥，尤其是結腸癌的發(fā)生，同時，攝入槲皮素可預防肺癌[25]。某些試驗表明，槲皮素的代謝產(chǎn)物是比槲皮素更好的人類多藥耐藥蛋白的抑制劑[26]。然而，不同濃度的槲皮素對癌細胞的作用是不同的，研究表明，當槲皮素濃度較高時，有抑制癌細胞增殖的效果，

57、當槲皮素濃度較低時，卻會促進癌細胞增殖[27]。</p><p>　　1.4.3 槲皮素的消炎作用</p><p>　　“炎癥”是機體對于刺激的一種防御反應，表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛。通常情況下，炎癥是有益的，是人體的自動的防御反應，但是有的時候，炎癥也是有害的，例如對人體自身組織的攻擊等。腸道感染時,腸道受病原微生物及其毒素刺激,化學性炎癥介質(zhì)分泌增加,使腸道蠕動加速,由于食物在腸道停留時間

58、縮短,快速地被排出體外,從而引起腹瀉。槲皮素具有一定抗炎活性,可以保護人體細胞，防止被沙門氏菌感染[28]，也可以通過改變腸道內(nèi)毛細血管通透性,減少水分和電解質(zhì)分泌,從而止瀉。</p><p>　　槲皮素廣泛分布于植物界中，是藥用植物的有效成分之一，在臨床上已被證明具有多種生物活性，如抗癌、抗氧化、抑菌等，而且毒副作用較小。目前，從各種植物中提取槲皮素的研究很多，且主要集中于從洋蔥和槐米中提取，只有劉維信[6]等

59、嘗試從大蔥蔥白中提取槲皮素，從大蔥葉中提取槲皮素的研究還近乎空白。因此，本文選取大蔥葉，進行槲皮素提取，以期為大蔥葉的深加工提供工藝參數(shù)和理論依據(jù)。</p><p>　　1.5本研究的意義和主要內(nèi)容</p><p>　　1.5.1本研究的意義</p><p>　　我國是大蔥資源大國，一直以來都有產(chǎn)量大但產(chǎn)值低的困擾。不過近年來大蔥深加工逐漸發(fā)展，而且非常迅速，加工用

60、蔥量逐年上升，很有可能改變傳統(tǒng)的大蔥消費結構。通過查閱文獻，發(fā)現(xiàn)由于大蔥葉中含有較多槲皮素，而從大蔥葉中提取槲皮素尚處于空白。由于槲皮素結構中富含酚羥基,故具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗癌變等多種生理功能,而其抗氧化的性質(zhì)又可起到抗衰老、抗突變、抗動脈粥樣硬化等作用[3]，近年來，抗氧化和抗腫瘤成為研究的熱點[4]，受到普遍關注。此外，槲皮素還具有較強的清除亞硝酸鹽的能力，都是非常值得探究的方面。</p><p>

61、　　通過前人的試驗發(fā)現(xiàn)超聲提取方法快捷、安全、可靠，與傳統(tǒng)提取方式比有較大優(yōu)勢，分光光度法操作簡便、快速、靈敏度高、準確度高、適用性廣，因此得到廣泛應用，大多無機離子和許多有機化合物都可以直接或間接地用該法進行測定，此法在測定槲皮素方面應用也較為廣泛，故本試驗擬采用超聲輔助提取法和分光光度法進行提取和測定。</p><p>　　1.5.2本研究的主要內(nèi)容</p><p>　　本文將在前人研

62、究的基礎上，進行超聲輔助提取大蔥葉中的槲皮素，利用分光光度法對槲皮素的含量進行測定，同時將對大蔥葉粗提物清除亞硝酸鹽的效果進行研究。</p><p>　　1、分別研究乙醇濃度、固液比、超聲功率、超聲時間、超聲溫度對大蔥葉中槲皮素提取率的影響，用單因素試驗篩選出對大蔥葉槲皮素提取率影響較大的因素，同時初選較優(yōu)的提取條件，再用響應曲面試驗進一步確定最佳工藝條件。</p><p>　　2、對大蔥

63、葉槲皮素清除亞硝酸鹽效果進行研究，同時將其清除效果與抗壞血酸溶液清除效果進行對比。</p><p>　　第2章 大蔥葉槲皮素的提取工藝研究</p><p><b>　　2.1引言</b></p><p>　　槲皮素廣泛分布于植物界中，是藥用植物的有效成分之一，在臨床上已被證明具有多種生物活性，如抗癌、抗氧化、抑菌等，而且毒副作用較小。目前，從

64、各種植物中提取槲皮素的研究很多，且主要集中于從洋蔥和槐米中提取，但從大蔥葉中提取槲皮素的研究還接近空白。本文選取大蔥葉，進行槲皮素提取，以期為大蔥葉的深加工提供工藝參數(shù)和理論依據(jù)。</p><p>　　2.2試驗材料、試劑與儀器 </p><p>　　2.2.1 試驗材料與試劑</p><p>　　大蔥：購于長春南街超市，去雜、去梗，60℃烘干12h，經(jīng)粉碎機粉碎后

65、，備用；槲皮素標準品：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇：北京化工廠，以上試劑均為分析純。</p><p>　　2.2.2試驗儀器與設備</p><p>　　KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；AL104電子天平：梅特勒—托利多儀器（上海）有限責任公司；FW177 型中草藥粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；LD4-2A低速離心機：北京雷勃爾離心機有限公司；TU-18

66、10紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。</p><p><b>　　2.3試驗方法</b></p><p>　　2.3.1超聲輔助提取法提取大蔥蔥葉中槲皮素的方法</p><p>　　在提取槲皮素的過程中，常采用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等溶劑，但考慮到槲皮素的性質(zhì)、有機溶劑的殘留、毒性與操作的安全性、揮發(fā)性、經(jīng)濟性和環(huán)保性等方

67、面的因素，乙醇無毒、易揮發(fā)、方便回收、使用較為安全，而且價格也較低，故本試驗選用乙醇作為大蔥葉槲皮素的提取劑。</p><p>　　2.3.2槲皮素化合物的測定</p><p>　　本試驗采用分光光度法對槲皮素含量進行測定，在一定波長處槲皮素有最大吸收峰，且吸光強度與槲皮素含量符合朗伯比爾定律，吸光強度與槲皮素含量成正比關系，故可以通過測定吸光度值來分析其含量。</p>&l

68、t;p>　　2.3.2.1檢測波長的選擇 </p><p>　　準確稱取槲皮素標準品1.25mg，用60%乙醇溶解，移入25mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容（0.05mg/mL），搖勻。以60%乙醇溶液為參比液在200～600 nm范圍內(nèi)掃描，得到其吸收光譜和最大吸收波長。計算機的具體操作步驟是：選擇光譜掃描，點擊測量，隨后進行參數(shù)設置，包括設置掃描起點（200nm）和終點（600nm）波長，選擇一號池

69、，點擊基線按鈕，完成后，選擇二號池，點擊開始按鈕，進行峰值檢出。</p><p>　　2.3.2.2標準曲線的繪制</p><p>　　準確稱取槲皮素標準品1.25mg，用60%乙醇溶解，移入25mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容（0.05mg/mL），搖勻，在特定波長下測定吸光度值，以槲皮素溶液濃度為橫坐標（x），吸光度值為縱坐標（y），繪制標準曲線。</p><p&

70、gt;　　2.3.2.3大蔥蔥葉中槲皮素提取率的測定</p><p>　　稱取0.500g大蔥粉，置于100mL錐形瓶中，加入一定體積一定濃度的乙醇溶液，攪拌均勻，用超聲波清洗儀按試驗條件進行超聲提取，然后將提取液在4000r/min轉速下離心10min，取上清液置于50mL容量瓶中，用相應濃度乙醇溶液定容，搖勻，取2mL置于10mL容量瓶，再用相應濃度乙醇溶液定容，搖勻，測定分光度值。</p>&

71、lt;p>　　大蔥槲皮素提取率的計算公式：</p><p>　　……………………………………………（2-1）</p><p>　　式中：Y—槲皮素提取率（mg/g）；K—稀釋倍數(shù)；X—槲皮素的質(zhì)量濃度（mg/mL）；V—定容后提取液的體積（mL）；M—所稱大蔥粉的質(zhì)量（g）。</p><p><b>　　2.4 單因素試驗</b><

72、/p><p>　　2.4.1乙醇濃度對槲皮素提取率的影響</p><p>　　稱取0.5000g槲皮素5份，置于100mL錐形瓶中，分別加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液15mL，用保鮮膜封住瓶口，在功率為200w，溫度為40℃條件下超聲35min，然后4000r/min離心10min，取上清液分別置于5個50mL容量瓶中，分別用50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液定

73、容，搖勻后分別取2mL溶液，再分別用50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液定容至10mL，進行檢測。每組做一次重復試驗。</p><p>　　2.4.2固液比對槲皮素提取率的影響</p><p>　　稱取0.5000g槲皮素5份，置于100mL錐形瓶中，分別加入60%乙醇溶液25mL、30mL、35mL、40mL、45mL，用保鮮膜封住瓶口，在功率為200w，溫度為40℃條件下超聲

74、35min，然后4000r/min離心10min，取上清液分別置于5個50mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容，搖勻后分別取2mL溶液，再用60%乙醇溶液定容至10mL，進行檢測。每組做一次重復試驗。 </p><p>　　2.4.3 超聲時間對槲皮素提取率的影響</p><p>　　稱取0.5000g槲皮素5份，置于100mL錐形瓶中，分別加入60%乙醇溶液15mL，用保鮮膜封住瓶口，在

75、功率為200w，溫度為40℃條件下分別超聲5 min、15 min、25 min、35 min、45min，然后4000r/min離心10min，取上清液分別置于5個50mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容，搖勻后分別取2mL溶液，再用60%乙醇溶液定容至10mL，進行檢測。每組做一次重復試驗。</p><p>　　2.4.4 超聲溫度對槲皮素提取率的影響</p><p>　　稱取0.500

76、0g槲皮素5份，置于100mL錐形瓶中，分別加入60%乙醇溶液15mL，用保鮮膜封住瓶口，在功率為200w，溫度分別為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃條件下超聲35min，然后4000r/min離心10min，取上清液分別置于5個50mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容，搖勻后分別取2mL溶液，再用60%乙醇溶液定容至10mL，進行檢測。每組做一次重復試驗。</p><p>　　2.4.5超聲功率對槲皮素提取

77、率的影響</p><p>　　稱取0.5000g槲皮素5份，置于100mL錐形瓶中，分別加入60%乙醇溶液15mL，用保鮮膜封住瓶口，在功率為分別為50W、100W、150W、200W、250W，溫度為40℃條件下超聲35min，然后4000r/min離心10min，取上清液分別置于5個50mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容，搖勻后分別取2mL溶液，再用60%乙醇溶液定容至10mL，進行檢測。每組做一次重復試驗。

78、</p><p><b>　　2.5工藝參數(shù)優(yōu)化</b></p><p>　　通過單因素試驗確定主要影響因素后，運用Box-Behnken設計(Box-Behnken Design, BBD)和響應曲面法(Response Surface Methodology)來優(yōu)化大蔥葉槲皮素的提取工藝，根據(jù)擬合的數(shù)學模型及方差分析的結果，并用響應面等高圖直觀地描繪其結果，最后通

79、過數(shù)學模型和響應面等高圖求出提取率最大時的最優(yōu)提取條件。</p><p><b>　　2.5.1設計方法</b></p><p>　　Box-Behnken設計是一類三水平的二次回歸設計，該設計可使用統(tǒng)計來完成數(shù)據(jù)處理，快速方便，且此方法在水平數(shù)為3時，試驗次數(shù)不多，使用起來經(jīng)濟方便，當水平數(shù)大于3時，試驗次數(shù)明顯增多，故當水平數(shù)大于3時很少使用這種設計[29]。同時

80、，此法可以建立曲面模型，也可對交互作用進行分析，方便有效。</p><p>　　在單因素試驗基礎上，根據(jù)Box-Benhken試驗設計原理，選取影響槲皮素提取率的三個主要因素：乙醇濃度、固液比、超聲時間進行優(yōu)化設計，因素水平設計見表2-1。</p><p>　　表2- 1 因素水平表</p><p>　　Tab.2-1 Levels of factors</p

81、><p>　　2.5.2響應曲面優(yōu)化法</p><p>　　響應面優(yōu)化法（Response Surface Methodology, RSM），是一種試驗條件尋優(yōu)的方法，適宜于解決非線性數(shù)據(jù)處理的相關問題。它涵蓋了試驗設計、建模、確定最優(yōu)條件等技術；通過回歸擬合、響應曲面、等高線，可分析出各因素及其水平的響應值，進而找出理論上的最優(yōu)值響應以及相應的試驗條件。</p><p&

82、gt;　　根據(jù)Box-Behnke設計試驗中的樣品的測量結果，然后應用Design-Expert軟件進行響應曲面分析，可得各因素對提取率的影響及交互作用，之后擬合回歸模型，并用響應面等高圖直觀地描繪其結果，找出預測的響應最優(yōu)值，優(yōu)化試驗條件。</p><p><b>　　2.6結果與分析</b></p><p>　　2.6.1檢測波長的選擇</p>&l

83、t;p>　　通過對以 80% 乙醇溶液為參比液，將槲皮素溶液在200～600 nm 波長范圍內(nèi)掃描，得到其吸收光譜，其最大吸收波長分別位于 256 nm 和 374nm 附近。結合前人的研究結果，本試驗采用374 nm為測定波長，光譜掃描曲線見圖2-1。</p><p>　　圖2- 1 光譜掃描曲線圖</p><p>　　Fig.2-1 Curve of spectral scann

84、ing </p><p>　　2.6.2 標準曲線的繪制</p><p>　　槲皮素的標準曲線見圖2-2，標準曲線方程為y=52.92x+0.129，R2=0.9994，吸光度與槲皮素標準溶液濃度在0.002～0.0014mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。</p><p>　　圖2- 2槲皮素標準曲線</p><p>　　Fig.2-2 Stan

85、dard curve of quercetin</p><p>　　2.6.3單因素試驗的顯著性分析方法</p><p>　　由諸樣本均值和樣本量，計算該單因素所有n個試驗數(shù)據(jù)的總平均值</p><p>　　…………………………………………（2-2）</p><p><b>　　算得因子A的平方和</b></p&g

86、t;<p>　　……………………………………（2-3）</p><p>　　由諸樣本標準差可算得組內(nèi)平方和</p><p>　　………………………………………（2-4）</p><p>　　由上述計算所得的方差分析表，見表2-2</p><p>　　表2- 2 方差分析表</p><p>　　Tab.2-

87、2 Variance analysis </p><p>　　5、判斷：當顯著性水平α=0.01時，查得F0.99（4，5）=11.39，若計算所得F>11.39，則該因子顯著，即表示該因子的不同水平之間有顯著性差異，且對提取率有顯著的影響，應作為主要影響因子進行進一步探究，反之則不顯著，即表示該因子的不同水平之間無顯著性差異，且對提取率無顯著的影響，不必進行進一步探究。</p><p&

88、gt;　　2.6.4 大蔥葉槲皮素提取單因素試驗結果分析</p><p>　　2.6.4.1 超聲時間對大蔥葉槲皮素提取率的影響</p><p>　　圖2- 3 超聲提取時間對槲皮素提取率的影響</p><p>　　Fig.2-3 Influence of ultrasonic extraction time on yields of quercetin</p

89、><p>　　由圖2-3可知，在一定試驗范圍內(nèi)，隨著超聲時間的增加，槲皮素提取率逐漸升高，超聲5分鐘時，提取率最低，為2.4187mg/g，在超聲時間為35min時，提取率達到最大值4.3509mg/g，若繼續(xù)延長超聲時間，會使提取率降低。這說明并非提取時間越長越好，這可能是由于長時間超聲處理，槲皮素在溶液中的濃度不斷上升，同時有少量膠體溶出，溶液的黏度增加，會阻礙槲皮素繼續(xù)溶出，同時，由于槲皮素自身不穩(wěn)定，若超聲時

90、間過長，槲皮素被破壞。</p><p>　　在顯著水平α=0.01時，查得分位數(shù)F0.99（4，5）=11.39，計算所得F=29.8529>11.39，表明該因子顯著，即不同的超聲時間對提取率有顯著的影響，應作為主要影響因子進行進一步探究，根據(jù)單因素結果，由于在超聲時間25～45min范圍內(nèi)，槲皮素有最大提取率，故選取超聲時間25～45min進行進一步探究。</p><p>　　2

91、.6.4.2固液比對大蔥葉槲皮素提取率的影響</p><p>　　圖2- 4 固液比對槲皮素提取率的影響</p><p>　　Fig.2-4 Influence of solid-liquid ratio on yields of quercetin</p><p>　　由圖2-4可知，隨著固液比例的增大，大蔥葉中槲皮素的提取率先緩慢上升，當達到1:80g/mL時

92、，提取率增大明顯，且達到最高值，為5.6217mg/mL，當固液比繼續(xù)增大，達到1:90，提取率略有下降。探究其原因，可能是槲皮素提取率的高低與其向溶劑擴散的難易程度有關，固液比太低，也就是溶劑量較少，會導致液相與固相之間的濃度差太小，不利于槲皮素的擴散出來[30]。故隨著乙醇溶液用量的增加，加大了大蔥葉粉末和液體的接觸面積，利于擴散，從而槲皮素的提取率得到提高，然而當固液比高于1:90時，已浸出的槲皮素抑制了未浸出槲皮素，致使提取率反

93、而下降[31]。</p><p>　　在顯著水平α=0.01時，查得分位數(shù)F0.99（4，5）=11.39，計算所得F=81.2857>11.39，表明該因子顯著，即不同的超聲時間對提取率有顯著的影響，應作為主要影響因子進行進一步探究，根據(jù)單因素結果，由于在固液比1:70～1:90范圍內(nèi)，槲皮素有較大提取率，故選取固液比1:70～1:90進行進一步探究。</p><p>　　2.6.

94、4.3 乙醇濃度對大蔥葉槲皮素提取率的影響</p><p>　　圖2- 5 乙醇濃度對槲皮素提取率的影響</p><p>　　Fig.2-5 Influence of ethanol concentration on yields of quercetin</p><p>　　由圖2-5可知，隨著乙醇濃度的上升，槲皮素提取率逐漸提高，當乙醇濃度達到80%時，提取率

95、達到最大，即為5.6217mg/g，當乙醇濃度繼續(xù)升高，達到90%時，槲皮素提取率反而下降。這可能與大蔥中槲皮素的極性有關，目標物質(zhì)越接近提取液的極性，提取效果將越好[32]，所以這里認為濃度為80%的乙醇與大蔥槲皮素極性較為相似。同時，當乙醇濃度增大到90%，一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性成分溶出增加，這些干擾會與槲皮素競爭結合乙醇-水分子，從而使槲皮素得率下降[33]。</p><p>　　在顯著水平α=0.0

96、1時，查得分位數(shù)F0.99（4，5）=11.39，計算所得F=104.7143>11.39，表明該因子顯著，即不同的乙醇濃度對提取率有顯著的影響，應作為主要影響因子進行進一步探究，根據(jù)單因素結果，由于在范圍內(nèi)，槲皮素有最大提取率，故選取乙醇濃度70%～90%進行進一步探究。</p><p>　　2.6.4.4 超聲功率對大蔥葉槲皮素提取率的影響</p><p>　　圖2- 6 超聲功

97、率對槲皮素提取率的影響</p><p>　　Fig.2-6 Influence of ultrasonic power on yields of quercetin</p><p>　　由圖2-6可知，隨超聲功率增加，槲皮素提取率先增大后減小，當超聲功率達到200W時，槲皮素的提取率最大，為4.7430 mg/g，在50W時提取率最小，為4.1879 mg/g，當功率達到250W，提取率

98、下降，這可能是由于槲皮素性質(zhì)不穩(wěn)定，在較高的振動強度下容易發(fā)生其他反應，從而使溶液中含量降低。從總體來看，超聲功率對槲皮素提取率的影響不大。</p><p>　　在顯著水平α=0.01時，查得分位數(shù)F0.99（4，5）=11.39，計算所得F=10.1765<11.39，表明該因子不顯著，即該因子的不同水平對提取率無顯著的影響，不必進行進一步探究。根據(jù)單因素結果，由于在超聲功率200W時，槲皮素有最大提取率

99、，故選擇功率200W進行后續(xù)的響應曲面試驗。</p><p>　　2.6.4.5超聲溫度對大蔥葉槲皮素提取率的影響</p><p>　　圖2- 7 超聲溫度對槲皮素提取率的影響</p><p>　　Fig.2-7 Influence of ultrasonic temperature on yields of quercetin</p><p&

100、gt;　　由圖2-7可知，槲皮素提取率在20～60℃范圍內(nèi)，隨溫度的升高先增大后減小，當超聲溫度達到50℃時，槲皮素的提取率最大，為4.4926 mg/g，在20℃時提取率最小，為3.9683 mg/g，當溫度升高到60℃，提取率下降，這可能是由于槲皮素性質(zhì)不穩(wěn)定，在高溫下容易發(fā)生其他反應，從而使溶液中含量降低。從總體來看，溫度對槲皮素提取率的影響不大。 </p><p>　　在顯著水平α=0.01時，查得分位數(shù)

101、F0.99（4，5）=11.39，計算所得F=7.893<11.39，表明該因子不顯著，即該因子的不同水平對提取率無顯著的影響，不必進行進一步探究。根據(jù)單因素結果，由于在超聲溫度為50℃時，槲皮素有最大提取率，故選擇超聲溫度為50℃進行后續(xù)的響應曲面試驗。</p><p>　　2.6.5響應面優(yōu)化試驗的結果分析</p><p>　　2.6.5.1 回歸模型的建立與分析</p&g

102、t;<p>　　在單因素試驗基礎上，對乙醇濃度、固液比、超聲時間三個因素對大蔥葉槲皮素提取率的影響進行進一步探究。令槲皮素提取率為響應值，進行響應面分析試驗，得出不同試驗條件下槲皮素的提取率，試驗結果見表2-13，回歸方程的方差顯著性分析結果見表2-14，模型可信度分析見表2-15。</p><p>　　以大蔥葉中槲皮素的提取率為響應值Y（mg/g）,經(jīng)二次回歸擬合后求得響應函數(shù)，即得回歸方程為：&

103、lt;/p><p>　　Y=6.96-0.23A-0.19B+0.18C+0.027AB+0.20AC+0.12BC-0.35A2-0.30B2+0.15C2</p><p>　　由表2-14可知，回歸模型顯著（P= 0.0140<0.05），失擬項不顯著（P= 0.2070>0.05），模型的擬合度為0.8847，表明響應值的88.47%來源于所選變量，僅有總變異的11.53%不

104、能用此模型來解釋，表明回歸方程能夠很好地表述各因素與響應值之間真實關系，可用該模型來替代真實試驗點來對試驗結果進行分析和檢測，模型的信噪比為7.403，一般來說，模型的信噪比大于4就是較好的模型，進一步說明本模型的設計是成功的。</p><p>　　一次項中，提取時間、乙醇濃度、固液比均達到了顯著水平；在二次項中，提取時間、乙醇濃度對槲皮素提取率的影響顯著，固液比不顯著；交互作用中，提取時間和乙醇濃度、乙醇濃度和

105、固液比及提取時間和固液比之間的交互作用不均顯著，但提取時間和固液比的交互作用的F值為0.0868，接近于0.05，故近似顯著。此外，影響大蔥葉中槲皮素提取率的因素主次為：提取時間>乙醇濃度>固液比。</p><p>　　表2- 13 槲皮素提取率響應曲面試驗及結果</p><p>　　Tab.2-13 Factors and levels in the response sur

106、face central composition design arrangement and experimental results</p><p>　　表2- 14 回歸模型方差分析表</p><p>　　Tab.2-14 Regression model analysis of variance table</p><p>　　表2- 15 模型可信度分析&

107、lt;/p><p>　　Tab.2-15 Model credibility analysis</p><p>　　2.6.5.2 響應面圖形分析</p><p>　　圖2- 8 提取時間（A）和乙醇濃度（C）對槲皮素提取率的影響</p><p>　　Tab.2-8 Response surface and contour plots illu

108、strating the interactive effect of ultrasonic extraction time and ethanol concentration on the extraction yield of quercetin</p><p>　　響應面圖形是響應值Y對應于試驗因素A、B、C所構成的三維空間的曲面圖及其在二維平面上的等高線圖，其可以直觀地反映各因素及他們之間的交互作用對響應值