‘國光’蘋果紅色芽變果實著色分子機理初步研究.pdf

1、蘋果（Malus domestica Borkh)是世界上最主要的鮮食果品之一，其果實色澤是重要的外觀品質，直接決定其商品價值?！畤?是20世紀80年代中國北方廣泛種植的蘋果品種之一，具有晚熟、酸甜適口及抗逆性強等特點，近年來再次受到消費者的青睞，但著色差一直是限制其發(fā)展的重要因素。2005年課題組在山東省五蓮縣發(fā)現(xiàn)了一株‘國光'的紅色突變，其突出的特點是比國光著色早，著色好，成熟時果面片紅。果皮的紅色主要由花青苷類物質的含量和成分決

2、定的，花青苷是由一系列的酶促反應生成的次生代謝物。前人以‘國光'為對照，從生理層面上對紅色芽變花青苷積累及合成途徑關鍵酶的活性進行了研究。本文在此基礎上，比較了兩試材中花青苷合成相關結構基因、調節(jié)基因的表達水平以及三個調節(jié)基因的編碼區(qū)，找出了引發(fā)紅色突變的關鍵基因；并通過對關鍵基因MdMYB1基因組和上、下游調控序列的擴增和比對，以及MdMYB1啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)的比較，闡明了MdMYB1表達量差異的原因。主要研究結果如下：

3、　　 1.果實發(fā)育后期正常光照條件下的果實MdCHS、MdF3H、和 MdUFGT表達量逐漸上升，采收前達到最大值；MdCHI、MdDFR1及MdLDOX的表達量亦逐漸上升，但在采收前略有下降；套袋處理（盛花后30天套袋，采收前30天除袋）的果實除袋前花青苷合成結構基因表達量均很低，除袋后迅速上升；與正常光照條件下的果實相比，套袋處理明顯提高了MdDFR1，MdLDOX及 MdUFGT的表達水平，但兩不同光照處理MdCHS，MdCHI

4、和 MdF3H的表達差異不大。兩種試材相對比，不同光照處理下紅色芽變6個結構基因表達水平均不同程度地高于‘國光'，且位于合成途徑下游的結構基因表達量差異更加明顯。類黃酮合成另兩條分支途徑中，黃酮醇合成酶基因MdFLS的表達水平明顯低于‘國光'，而單寧生物合成途徑中無色花色素還原酶基因MdLAR1和MdANR的表達量在兩種試材中差異不明顯，僅個別階段芽變表達量略低。
　　 2.根據(jù)MdMYB1，MdbHLH3及 MdbHLH33的

5、cDNA序列設計特異引物，分別從‘國光'及其紅色芽變中克隆出以上三個花青苷合成調節(jié)基因的編碼區(qū)并進行測序比對。結果表明兩種試材中MdMYB1和 MdbHLH3兩種調節(jié)基因的編碼序列完全一致，編碼結構相同的蛋白質；MdbHLH33蛋白的結構略有差異：氨基酸序列中第304位的氨基酸不同，‘國光'為甲硫氨酸（Met），而芽變中為蘇氨酸（Thr）。
　　 3．正常光照條件下，MdMYB1的表達量隨著果實成熟逐漸升高，后期達到最大值并略微

6、呈現(xiàn)下降趨勢；套袋處理果實除袋前MdMYB1表達量很低，除袋后迅速上升。與正常光照條件下的果實相比，套袋處理明顯提高了MdMYB1的表達水平。兩種試材相對比，不同光照處理下芽變MdMYB1的表達量均明顯高于‘國光'。MdbHLH3的表達與花青苷積累相關性不明顯，MdbHLH33的表達與MdMYB1顯著相關；兩試材MdbHLH3和MdbHLH33的表達量無明顯差異。
　　 4.對‘國光'及其芽變MdMYB1基因組及上、下游序列進行

7、克隆比對，瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示對應序列的長度無差異，說明芽變MdMYB1內含子及上、下游調節(jié)序列中無基因片段如反轉錄轉座子等插入或缺失；對基因片段進行測序比對，也未發(fā)現(xiàn)兩種試材中有明顯差異，說明芽變MdMYB1未發(fā)生DNA水平上的變化。對兩種試材MdMYB1啟動子區(qū)甲基化水平進行比較，發(fā)現(xiàn)紅色芽變-965～-416區(qū)域甲基化水平明顯低于‘國光'。
　　 綜上所述，紅色芽變中花青苷合成結構基因表達水平協(xié)同上調；MdMYB1表達量