小麥矮腥黑穗菌超分支滾環(huán)擴增檢測體系的建立及基因組文庫的構(gòu)建.pdf

1、小麥矮腥黑穗病(Wheat Dwarf Bunt Disease，DB)是一種重要的國際檢疫性病害，在麥類黑穗病中危害最大，對小麥生產(chǎn)具有毀滅性危害，其病原菌是小麥矮腥黑穗菌(Tilletia controversa Kühn，TCK)，主要分布在美洲、歐洲、北非和西亞，尤其是美國西北部7州。TCK作為一種典型的土傳病害，目前還沒有有效的防治方法。從六十年代起，我國就把此病害列為檢疫對象，并多次從美國、加拿大、歐盟的進口小麥中截獲具有侵

2、染活性的TCK。小麥矮腥黑穗病風險評估表明，我國有19.3％的冬小麥種植區(qū)屬中、高風險區(qū)，目前我國種植的小麥品種都是易感品種，引進的抗病品種選育正在進行。
　　 植物有害生物的檢測方法很多，包括癥狀目測法、病原菌分離培養(yǎng)及致病性測定法、血清學鑒定以及PCR檢測技術等，特別是PCR技術和熒光定量PCR檢測技術的應用使植物疫害生物的檢驗檢疫工作有了一種更加快速、準確、靈敏、便捷的檢測方法。然而除了PCR技術之外，其它技術都存在工作量

3、大、耗時費事、主觀性強等缺點，不能滿足進境原糧檢疫的快速通關以及進境后疫麥中病原菌消長動態(tài)與流向監(jiān)控的需求。并且所有的這些檢測技術都只能檢測單一的靶標。而進口麥類種子往往攜帶多種黑粉菌；盡管多重PCR能夠進行多靶標檢測，但是，不同引物對之間的競爭和相互抑制常常影響到檢測的特異性和穩(wěn)定性，使得檢測體系難以優(yōu)化而且不夠穩(wěn)定。鎖式探針(padlock probe)是一種較長的單鏈寡核苷酸片段，兩個末端在靶標序列上毗鄰并互補，中間的一段連接序列

4、對檢測結(jié)果沒有影響，可以用來設計擴增鎖式探針的通用引物。鎖式探針這種獨特的設計，滿足了特異性與多靶標檢測的需要，具有多種擴增方式，還能夠攜帶檢測標記物，是一種可以適應多種植物病原菌同步檢測的技術。
　　 本研究以重要植物檢疫性病害小麥矮腥黑穗菌為研究對象，以TCK獨有序列(1322bp)作為檢測靶標片段，以小鼠保守的Xist基因序列作為鎖式探針的通用連接序列，設計鎖式探針及其擴增引物；通過優(yōu)化連接體系、外切酶消化體系和滾環(huán)擴增程

5、序，以構(gòu)建小麥矮腥黑穗病菌的超分支滾環(huán)擴增(hyper-branched rollingcircle amplification，HRCA)體系，并以常規(guī)PCR和SYBR GreenⅠ熒光定量PCR作驗證，測試滾環(huán)擴增檢測的特異性、靈敏度；通過實際樣品的檢測確定了小麥矮腥黑穗菌滾環(huán)擴增檢測技術的特異性和靈敏度和穩(wěn)定性，為出入境植物檢驗檢疫提供了一種快速、靈敏、準確的新檢測技術。構(gòu)建小麥矮腥黑穗菌基因組DNA文庫，為后續(xù)功能基因的篩選、鑒

6、定以及致病機制和小麥的抗矮腥黑穗病遺傳育種奠定基礎。主要研究結(jié)果如下：
　　 ①根據(jù)小麥矮腥黑穗病菌(TCK)獨有序列設計一條特異的鎖式探針，并對探針的特異性及其專化性進行了測試，實驗表明設計的鎖式探針能識別單堿基錯配，當錯配位置在PLP的3’端時，很容易被識別而不會被連接，但是當錯配位置在PLP的5’端時，將不容易被識別。表明設計的鎖式探針具有良好的位點專一性，能夠用于靶標疫害生物的檢測。
　　 ②建立了基于鎖式探針的

7、小麥矮腥黑穗菌滾環(huán)擴增檢測體系，為小麥矮腥黑穗病的早期診斷提供了一種新的穩(wěn)定、可靠的檢測技術。能專一的檢測出不同TCK菌株的DNA靶帶，而對TCT的不同菌株和其他近源種DNA以及健康小麥樣品都不能擴增，特異性檢測結(jié)果與常規(guī)PCR的相同；HRCA檢測體系對重組質(zhì)粒的檢測靈敏度可達1fg/μL，相當于靶標基因拷貝數(shù)220 copy/μL，對TCK基因組DNA的檢測靈敏度可達10 pg/μL，比常規(guī)PCR的靈敏度高出一個數(shù)量級，而比SYBRG

8、reenⅠ實時熒光定量PCR的靈敏度低了一個數(shù)量級，表明建立的HRCA檢測體系具有良好的特性、靈敏度。
　　 ③建立的HRCA檢測體系初步應用于田間樣品中TCK的早期鑒定，可快速鑒定小麥矮腥黑穗菌冬孢子和菌絲體，小麥植株樣品的實際檢測結(jié)果與PCR驗證結(jié)果基本一致，表明所建立的滾環(huán)擴增體系適合于小麥矮腥黑穗菌實際樣品的早期診斷鑒定。
　　 ④建立了小麥矮腥黑穗菌大片段基因組DNA文庫，文庫的滴度為1.8×10cfu/ml，