天敵對稻飛虱捕食作用的評價方法研究——多重實時熒光定量PCR方法的研究和初步應(yīng)用.pdf

1、褐飛虱Nilaparvatalugens、灰飛虱Laodelphaxstriatellus和白背飛虱Sogatellafurcifera，屬同翅目飛虱科(Homoptera:Delphacidae)，是我國水稻上的最重要害蟲；稻田生態(tài)系統(tǒng)中，捕食性天敵的種類和數(shù)量非常豐富，在控制稻飛虱為害方面起著重要的作用；明確捕食性天敵種類以及各種捕食性天敵對稻飛虱控制作用的大小是充分發(fā)揮天敵控制作用的基礎(chǔ)和前題。本研究通過PCR克隆得到白背飛虱、褐

2、飛虱和灰飛虱的ITS基因序列，設(shè)計合成了三種飛虱的引物和特異性ALLGlo探針，建立優(yōu)化了ALLGlo探針三重實時熒光定量檢測體系和方法，并應(yīng)用該方法對稻田常見捕食性天敵對稻飛虱的捕食作用進行了研究。獲得的主要結(jié)果如下： 1.利用PCR方法克隆了白背飛虱、褐飛虱和灰飛虱的線粒體細胞色素氧化酶亞基(COI)基因和內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)域(ITS1和ITS2)基因，三種飛虱的COI，ITS1和ITS2基因序列分析表明：COI，ITS1和IT

3、S2在白背飛虱、褐飛虱和灰飛虱種間的相似性分別為89.02％，67.98％和70.11％. 2.利用白背飛虱、褐飛虱和灰飛虱的ITS2基因序列，設(shè)計合成了一對這三種飛虱特有的引物，該引物不與稻田其它主要害蟲、天敵和中性昆蟲基因組DNA發(fā)生擴增作用，具有這三種稻飛虱的特異性；該引物對白背飛虱、褐飛虱和灰飛虱基因組DNA的擴增片段長度分別為192，215和207bp；利用該引物建立了多重PCR體系，該體系可定性檢測捕食性天敵消化道內(nèi)

4、殘留的飛虱基因組DNA。 3.根據(jù)ALLGlo探針設(shè)計原則，選取白背飛虱、褐飛虱和灰飛虱的ITS2基因序列，利用PrimerExpress2.0軟件，設(shè)計合成了白背飛虱、褐飛虱和灰飛虱引物和特異性ALLGlo探針；通過調(diào)整引物、探針、dNTP和酶濃度，建立優(yōu)化了三重實時熒光定量檢測體系。該體系僅與這三種稻飛虱發(fā)生反應(yīng)，具有高度的特異性，該三重實時熒光檢測體系對白背飛虱標準質(zhì)粒的靈敏度為100個拷貝，標準曲線為y=-3.8251g

5、x+45.391，R2=0.99，擴增效率為182.57％，動態(tài)范圍為l02～107；褐飛虱標準質(zhì)粒的靈敏度為1000個拷貝，標準曲線為y=-3.7821gx+43.786，R2=0.98，擴增效率為183.82％，動態(tài)范圍為l03～107；灰飛虱標準質(zhì)粒的靈敏度為100個拷貝，標準曲線為y=-3.6481gx+42.898，R2=0.99，擴增效率為187.98％，動態(tài)范圍為l02～107。干擾實驗證明，將不同模板按不同濃度組合，當兩

6、種飛虱模板濃度即使相差10000倍時，低濃度的質(zhì)粒DNA仍然能夠檢測到，并且具有很高的相關(guān)性，決定系數(shù)R2達到0,99以上；同時，捕食者基因組DNA對獵物DNA的多重實時定量PCR不存在抑制作用或降低擴增效率。 4.定量檢測結(jié)果表明單頭白背飛虱長翅雌蟲目標拷貝數(shù)為111192839，標準差為8873990，變異系數(shù)為7.98％；單頭褐飛虱長翅雌蟲目標拷貝數(shù)為860074796，標準差44151965，變異系數(shù)為5.13％；單頭灰

7、飛虱長翅雌蟲目標拷貝數(shù)為274680423，標準差為8690453，變異系數(shù)為3.16％。添加回收實驗表明CTAB裂解法提取基因組DNA過程中目標拷貝的平均損失率為10.66％，因此可以用CTAB法提取捕食者消化道內(nèi)殘留的微量獵物基因組DNA。單頭白背飛虱、褐飛虱和灰飛虱長翅型雌性成蟲在擬環(huán)紋豹蛛消化道內(nèi)的降解曲線分別為：白背飛虱，y=0.548x+21.594，決定系數(shù)R2=0.8744，經(jīng)28h消化后，殘留約1580個拷貝；褐飛虱y

8、=0.2075x+22.257，決定系數(shù)R2=0.5047，經(jīng)32h消化后，殘留約23870個拷貝；灰飛虱，y=0.5304x+20.588，決定系數(shù)R2=0.8125，經(jīng)24h消化后，殘留約2710個拷貝。 5.應(yīng)用多重實時熒光定量PCR研究了嘉興單季晚稻田主要捕食性天敵對白背飛虱、褐飛虱和灰飛虱的捕食作用。結(jié)果表明，在稻田生態(tài)系統(tǒng)中，白背飛虱、褐飛虱和灰飛虱有多種共同的捕食性天敵，不同捕食者對不同獵物的陽性反應(yīng)率不同。就白背

9、飛虱而言，八斑球腹蛛陽性率最高達73.64％，最低的黑肩綠盲蝽也達到34.94％；對褐飛虱而言，黑肩綠盲蝽陽性率最高達72.06％，最低的為錐腹肖蛸僅有12.71％；對灰飛虱而言，擬環(huán)紋豹蛛陽性率最高達79.14％，最低的為錐腹肖蛸也達到44.92％。 6.不同捕食者對三種稻飛虱獵物留量存在很大差異。在整個水稻生長期內(nèi)，就白背飛虱、褐飛虱和灰飛虱來說，都是擬環(huán)紋豹蛛消化道內(nèi)獵物平均殘留最高，分別為53600拷貝，13587277

10、拷貝和3829821拷貝。對白背飛虱黑肩綠盲蝽平均殘留拷貝數(shù)最少，為5214拷貝；對褐飛虱食蟲瘤胸蛛平均殘留拷貝數(shù)最少，為500151拷貝；對灰飛虱錐腹肖蛸平均殘留拷貝數(shù)最少，為32957拷貝。 7.對三個不同調(diào)查時間的捕食性天敵消化道內(nèi)飛虱殘留種類、構(gòu)成進行分析。對于灰飛虱和白背飛虱在7月上前后遷入，褐飛虱在7月下～8月上遷入的遲栽單季晚稻，分蘗末期(8月14日)時擬環(huán)紋豹蛛、八斑球腹蛛和食蟲瘤胸蛛主要以白背飛虱和灰飛虱為主，

11、并且有相當高比例的捕食者消化道內(nèi)一種飛虱都沒有；抽穗期(9月14日)和灌漿期(10月10日)時擬環(huán)紋豹蛛、八斑球腹蛛、食蟲瘤胸蛛和黑肩綠盲蝽消化道內(nèi)的獵物種類多樣性增加，褐飛虱和灰飛虱成為主要獵物，陽性率最高達100％。同時，消化道內(nèi)三種飛虱殘留都存在的比例也大幅增加，甚至達到80％。結(jié)果表明，擬環(huán)紋豹蛛、八斑球腹蛛、食蟲瘤胸蛛和黑肩綠盲蝽對褐飛虱和灰飛虱的捕食主要受兩種飛虱種群數(shù)量的影響，隨著兩種飛虱種群數(shù)量的增加，擬環(huán)紋豹蛛、八斑球

12、腹蛛、食蟲瘤胸蛛和黑肩綠盲蝽的獵物種類和構(gòu)成都相應(yīng)增加。 8.比較同一時期和不同時期，不同捕食者對白背飛虱、褐飛虱和灰飛虱捕食作用殘留量可知：從9月上旬到10月下旬，擬環(huán)紋豹蛛、八斑球腹蛛、食蟲瘤胸蛛和黑肩綠盲蝽消化道內(nèi)殘留褐飛虱都較高；從8月上旬到9月中旬，擬環(huán)紋豹蛛和八斑球腹蛛消化道內(nèi)殘留灰飛虱較高，9月中旬后，擬環(huán)紋豹蛛、八斑球腹蛛、食蟲瘤胸蛛和黑肩綠盲蝽消化道內(nèi)殘留灰飛虱也較高；對白背飛虱而言，整個水稻生長期，這幾種捕食