雙孢蘑菇基質(zhì)降解能力退化分子機(jī)理的初步研究.pdf

1、雙孢蘑菇[Agaricus bisporus(J.E.Lange)Imbach]是世界性栽培與消費(fèi)的食用菌，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和生態(tài)意義。As2796是我國多年來唯一的雙孢蘑菇主栽品種，對其退化現(xiàn)象的分子機(jī)理研究具有重要的理論和實踐意義。在本課題中，我們應(yīng)用As2796正常菌株及其兩個基質(zhì)降解能力退化突變體菌株2796-3、2796-5作為比較研究的對象。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 (1)對雙孢蘑菇2個基質(zhì)降解能力退化菌株進(jìn)

2、行多代的無性繁殖(轉(zhuǎn)管)試驗及退化性狀檢測，確定了該退化現(xiàn)象可以穩(wěn)定存在。對正常與退化菌株進(jìn)行了混合接種試驗，排除了病毒等微生物感染的因素，證明了該退化性狀應(yīng)是基因變異所引起的。進(jìn)行了不同液體培養(yǎng)基的設(shè)計與培養(yǎng)，獲得3個菌株在4種培養(yǎng)基中的12個菌絲體樣品進(jìn)行后續(xù)的研究。
　　 (2)對雙孢蘑菇As2796及其分解基質(zhì)能力退化菌株2796-3、2796-5的總DNA進(jìn)行了153對引物組合的SRAP分析，結(jié)果未能發(fā)現(xiàn)兩類菌株DNA

3、水平的差異。根據(jù)試驗結(jié)果推測，該退化變異的范圍較窄，有可能是個別基因的突變，因而在DNA水平上難以發(fā)現(xiàn)。
　　 (3)應(yīng)用同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)技術(shù)對4種不同液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的雙孢蘑菇As2796及其基質(zhì)降解能力退化菌株2796-3、2796-5的菌絲體進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在部分培養(yǎng)基中正常與退化菌株的酯酶(EST)和多酚氧化酶(PPO)同工酶表型有明顯差異，且2個退化菌株的同工酶表型變異一致，說明雙孢蘑菇基質(zhì)降解能

4、力的退化與同工酶活性存在相關(guān)性。
　　 (4)對4種不同液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的雙孢蘑菇As2796及其基質(zhì)降解能力退化菌株2796-3、2796-5進(jìn)行了24對引物組合的mRNA差異顯示(DDRT-PCR)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8對引物組合擴(kuò)增出可重復(fù)的差異，并克隆了9條差異片段。序列分析結(jié)果顯示9條差異片段代表了5個基因的差異，部分與不同生物的ATP結(jié)合盒式運(yùn)輸亞家族A某蛋白、碳水化合物酯酶家族4蛋白、幾丁質(zhì)脫乙?；?、乙酰木聚糖酯酶Ⅱ及其

5、它一些未知蛋白具有較高的同源性。
　　 (5)構(gòu)建了雙孢蘑菇As2796菌株的全長cDNA文庫，文庫初始庫容達(dá)3.3×106cfu/mL，插入片段長度范圍約0.7-4.0Kb，平均長度約1.5Kb，重組率約82％，全長率約35％。文庫擴(kuò)增出了DDRT-PCR的5個差異基因全長編碼序列(CDS)，表明了該文庫的有效性，今后可用于擴(kuò)增所需的雙孢蘑菇正?；虻娜LcDNA或CDS。
　　 (6)以雙孢蘑菇As2796及其2個退

6、化菌株的總DNA為模板，擴(kuò)增出了DDRT-PCR中5個差異片段所在基因帶內(nèi)含子的編碼序列及其上游約1200bp調(diào)控序列并進(jìn)行克隆與測序比較，結(jié)果表明這些基因與上游序列在三個菌株中并無實質(zhì)性差異，據(jù)此推測退化性狀更可能是調(diào)控蛋白基因變異所引起的。
　　 (7)對雙孢蘑菇總蛋白質(zhì)的雙向電泳(2-DE或2D-PAGE)條件進(jìn)行了摸索與優(yōu)化，建立了雙孢蘑菇蛋白質(zhì)的2D-PAGE技術(shù)，獲得了清晰的2D-PAGE圖譜。結(jié)果表明雙孢蘑菇的蛋白

7、質(zhì)大部分集中在分子量20-120KDa、等電點(diǎn)pI5.2-7.8的范圍內(nèi)。
　　 (8)對雙孢蘑菇As2796及其基質(zhì)降解能力退化菌株2796-3、2796-5進(jìn)行了2D-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)了2個明顯的、可重復(fù)的差異蛋白質(zhì)，在退化菌株中分別為上調(diào)和下調(diào)表達(dá)，且2個退化菌株表現(xiàn)一致。根據(jù)質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析和數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果，2個差異蛋白質(zhì)初步鑒定為肌動蛋白和NADH脫氫酶鐵硫蛋白3，它們與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)或轉(zhuǎn)錄調(diào)控等

8、過程關(guān)系密切。
　　 本研究首次發(fā)現(xiàn)了一些與雙孢蘑菇基質(zhì)降解能力退化相關(guān)的基因片段與蛋白質(zhì)(酶)，基于本研究結(jié)果提出雙孢蘑菇基質(zhì)降解能力退化分子機(jī)理是一個多級鏈?zhǔn)綉?yīng)答(逐級調(diào)控)過程的初步設(shè)想。即基質(zhì)降解能力上的退化現(xiàn)象不是單一結(jié)構(gòu)蛋白基因的變異，而可能是調(diào)控基因的變異，導(dǎo)致基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的改變，最終在轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)水平、細(xì)胞水平及生物體上表現(xiàn)出系列差異，造成菌株在基質(zhì)降解能力上的退化現(xiàn)象。該設(shè)想為進(jìn)一步深入研究雙孢蘑菇分解基質(zhì)