‘岱玉杏’抗寒基因AmEBP1轉(zhuǎn)化試驗(yàn)研究.pdf

1、杏(Armeniaca vulgaris Lam.)系薔薇科(Rosaceac)杏屬植物。杏原產(chǎn)于我國，種質(zhì)資源極為豐富,是中國栽培歷史最久的果樹之一。但由于春季低溫和晚霜，常使花芽、花，甚至幼果受凍，產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益受到極大的損失，因此選育抗寒性強(qiáng)的品種有重要意義。近十幾年來，國內(nèi)外迅速發(fā)展的轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)在育種中得到了廣泛的應(yīng)用，并且已經(jīng)取得了長足發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成為改良品種最有前途的技術(shù)方法之一。花粉管導(dǎo)入法在農(nóng)作物上取得了令人

2、鼓舞的成績，但是在果樹上應(yīng)用的研究卻極少，由于果樹育種周期長，不斷地摸索試驗(yàn)快速有效的育種方法是很有意義的。本研究對杏進(jìn)行了抗寒基因轉(zhuǎn)化試驗(yàn)研究，并成功將沙冬青抗寒基因AmEBP1 通過花粉管成功轉(zhuǎn)化入岱玉杏T0 代中，并對組培苗進(jìn)行生理指標(biāo)測定，其主要研究內(nèi)容如下：
　　 1.岱玉杏×凱特杏雜交親和，坐果率達(dá)到57％，果實(shí)橫徑、縱經(jīng)、側(cè)徑可達(dá)4.081cm,4.403cm,4.412cm，均高于自然授粉的岱玉杏，表現(xiàn)出現(xiàn)雜種優(yōu)

3、勢。不同處理導(dǎo)入DNA對轉(zhuǎn)化率有一定影響，切除1/2 柱頭滴注外源DNA能提高轉(zhuǎn)化率，但對坐果率有一定影響；花粉基因處理的坐果率較正常花粉坐果率下降9.5％；
　　 2.采用不同濃度DNA 導(dǎo)入對轉(zhuǎn)化率有一定的影響，當(dāng)DNA 濃度分別為200μg/mL、500μg/mL、800μg/mL 時，坐果率分別為21.5％、26.4％、12.7％，坐果率沒有隨著外源DNA 濃度高低而逐漸升高或降低，而是以500μg/mL的濃度相對比較高

4、,3個DNA 濃度處理的坐果率遠(yuǎn)低于對照；導(dǎo)入DNA 濃度在500μg/mL 時，切除花柱1/2 時轉(zhuǎn)基因成功率最高，在第7天時能達(dá)到75％，60天后為30％，但基因?qū)牒箅S時間的延長，陽性比率仍然出現(xiàn)下降的趨勢，說明基因丟失仍然存在。
　　 3.采用改良的WPM 培養(yǎng)基，對岱玉杏不同胚發(fā)育時期培養(yǎng)結(jié)果得出，在改良WPM培養(yǎng)基上，PF值高于0.3 時才能形成愈傷，附加激素BA 在0.6 mg/mL-0.8 mg/mL 時，愈傷誘

5、導(dǎo)率最高，在PF=0.7 時成苗率最高；成熟胚在MS和改良WPM上均能萌動，但有葉小、卷曲、畸形、或玻璃化，根芽生長不良的情況出現(xiàn)。
　　 4.在對岱玉杏，大果杏，凱特杏，金太陽4個品種成熟胚培養(yǎng)結(jié)果表明，低溫處理的時間和4個品種杏的萌發(fā)呈現(xiàn)正相關(guān)，隨著低溫處理時間的延長,4個品種杏的萌動跡象越發(fā)明顯，成苗率都有提升。大果杏在處理60天后，大田出苗率基本可以達(dá)到100﹪，是最易成苗的品種。岱玉杏無論種胚腐爛率很高，在60﹪以上。

6、5.本研究得到岱玉杏轉(zhuǎn)基因苗木。16 株經(jīng)過PCR 檢測陽性，Southern 雜交檢測有11個分別出現(xiàn)1-3條雜交帶，另一個轉(zhuǎn)基因植株中只出現(xiàn)了微弱的雜交帶，證明AmEBP1基因已經(jīng)整合到T0 代組培苗中。
　　 6.通過對轉(zhuǎn)基因株系與未轉(zhuǎn)基因株系組培苗抗寒生理對比，轉(zhuǎn)基因株系（組培苗）LT50為-4.37℃＜對照-4.12℃；SOD、POD活性與可溶性蛋白含量在-5℃到-10℃之前達(dá)到最大值，總體均有先升后降的趨勢，并有轉(zhuǎn)基