PEG介導(dǎo)的玉米絲軸黑粉菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化與ras、gpd啟動(dòng)子的克隆.pdf

1、玉米絲黑穗病是由玉米絲軸黑粉菌(Sporisorium reilianum f.sp.Zeae)引起的嚴(yán)重威脅玉米產(chǎn)量的系統(tǒng)性病害,一般在苗期侵染,穗期表現(xiàn)典型癥狀,主要危害果穗和雄穗,一旦發(fā)病,往往全株沒(méi)有收成。本研究旨在構(gòu)建PEG介導(dǎo)的玉米絲軸黑粉菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系,并嘗試克隆該菌基因組中ras、gpd基因的啟動(dòng)子,為發(fā)展出高效的玉米絲軸黑粉菌遺傳轉(zhuǎn)化體系和闡明其致病機(jī)制等方面奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:
　　 1、對(duì)玉米絲軸黑

2、粉菌原生質(zhì)體形成和再生條件進(jìn)行探究,供試菌株為本實(shí)驗(yàn)室分離的絲軸黑粉菌菌株SR1,研究了不同菌齡、不同單酶以及不同濃度的單酶組合成混合酶液后的酶解效率,探討了滲透壓穩(wěn)定劑、酶解溫度、酶解時(shí)間等影響原生質(zhì)體形成和再生的條件,得到了制備玉米絲軸黑粉菌原生質(zhì)體的最優(yōu)條件:SR1活化3d后以1/20的接種量繼續(xù)培養(yǎng)約24h,離心收集擔(dān)孢子用無(wú)菌水洗滌一次,加入含0.5％裂解酶、5％崩潰酶和5％蝸牛酶三種酶混合液(酶液以1.0M/L山梨醇配制)酶

3、解,置于28℃、轉(zhuǎn)速為100r/m的搖床上溫育10min,原生質(zhì)體產(chǎn)量可達(dá)1.35×108個(gè)/mL,得率可達(dá)到99.4％,再生率達(dá)35.6％。
　　 2、質(zhì)粒DNA經(jīng)PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米絲軸黑粉菌原生質(zhì)體,轉(zhuǎn)化效率約10個(gè)轉(zhuǎn)化子/μgDNA。篩選出穩(wěn)定表達(dá)潮霉素B抗性的轉(zhuǎn)化菌株,繼代培養(yǎng)9代后仍有潮霉素抗性。PCR驗(yàn)證表明,外源DNA已經(jīng)插入到絲軸黑粉菌基因組上,隨絲軸黑粉菌轉(zhuǎn)代而穩(wěn)定遺傳。
　　 3、克隆玉米絲軸黑粉菌r

4、as與gpd啟動(dòng)子,以玉米絲軸黑粉菌基因組DNA為模板,根據(jù)以往報(bào)道的ras與gpd啟動(dòng)子相關(guān)序列設(shè)計(jì)引物,利用PCR方法克隆了ras、gpd1和gpd2三個(gè)啟動(dòng)子片段。DNA測(cè)序后經(jīng)Blastn分析表明,ras序列與網(wǎng)上公布的香菇ras啟動(dòng)子序列有98％的同源性,gpd與草菇gpd基因啟動(dòng)子序列的同源性達(dá)99％。采用Promoter2.0 Prediction軟件分析發(fā)現(xiàn)ras、gpd2為啟動(dòng)子的可能性很大,分值達(dá)0.652、0.56