大豆脂肪氧化酶基因RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)調(diào)控的研究.pdf

1、本項研究應(yīng)用基因工程手段，克隆大豆脂肪氧化酶基因核心保守序列，構(gòu)建高效的具有hpRNA和ihpRNA結(jié)構(gòu)的大豆脂肪氧化酶基因RNAi表達(dá)載體。通過花粉管通道法將其導(dǎo)入大豆，抑制大豆脂肪氧化酶基因的表達(dá)，調(diào)控脂肪氧化酶的生物合成過程。以期通過基因工程手段，改變大豆脂肪氧化酶合成途徑，降低大豆脂肪氧化酶含量，提高大豆油份含量，培育具有優(yōu)良品質(zhì)的大豆品種。取得如下結(jié)果： 1.改造植物表達(dá)載體pCAMBIA1301，去除其臂內(nèi)潮酶素基因

2、，并在臂內(nèi)按逆時針方向添加一個從質(zhì)粒pBI121上酶切下來的35S啟動子。 2.以大豆品種“吉農(nóng)18號”的基因組DNA為模板，選取大豆三種脂肪氧化酶同功酶基因同源性最高部分，通過PCR擴增得到大豆脂肪氧化酶基因片段，將其克隆到pMD18-Tvector載體上，測序結(jié)果表明：克隆片段大小為357bp。對比NCBI基因Bank，與已發(fā)表的基因一致。將大豆脂肪氧化酶基因片段按正向+反向的順序插入到pCAMBIA130135S啟動子下，

3、構(gòu)建大豆脂肪氧化酶基因hpRNA干擾表達(dá)載體pC1301LoxRi。通過花粉管通道法轉(zhuǎn)化大豆品種“吉農(nóng)18號”，獲得T0代轉(zhuǎn)化籽粒，萌發(fā)后以單棵植株葉片的總DNA為模板，以pCAMBIA1301臂內(nèi)GUS基因設(shè)計一對引物進行PCR擴增，結(jié)果從6棵植株中擴增得到720bp的特異帶，回收該條帶連接于pMD18-Tvector載體并測序，結(jié)果顯示其為要擴增的GUS基因片段。為進一步確定外源基因的整合情況，從PCR陽性植株中隨機抽取2株進行So

4、uthern blot分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化株均有雜交帶出現(xiàn)，外源基因以單拷貝和雙拷貝的形式插入，而未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植株沒有雜交信號出現(xiàn)，證明外源基因已整合到大豆基因組中。以轉(zhuǎn)基因大豆籽粒的總RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板做RT-PCR，從電泳條帶的亮度上看，轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株的內(nèi)標(biāo)18SRNA含量相同，而內(nèi)源脂肪氧化酶mRNA的含量明顯降低。 3.克隆了大豆“吉農(nóng)18號”自身的一段內(nèi)含子，片段長度230bp，將其插入到表達(dá)載體p

5、C1301LoxRi的正義基因片段和反義基因片段中間，構(gòu)建大豆脂肪氧化酶基因ihpRNA干擾表達(dá)載體pC1301LoxiRi。通過花粉管通道法轉(zhuǎn)化大豆品種“吉農(nóng)18號”，獲得T0代轉(zhuǎn)化籽粒，萌發(fā)后以單棵植株葉片的總DNA為模板，以pCAMBIA1301臂內(nèi)T-DNA區(qū)GUS基因設(shè)計一對引物進行PCR擴增，結(jié)果從18棵植株中擴增得到720bp的特異帶，回收該條帶連接于pMD18-Tvector載體并測序，結(jié)果顯示其為要擴增的GUS基因片段

6、。為進一步確定外源基因的整合情況，從PCR陽性植株中隨機抽取3株進行Southern blot分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化株均有雜交帶出現(xiàn)，外源基因以單拷貝和雙拷貝的形式插入，而未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植株沒有雜交信號出現(xiàn)，證明外源基因已整合到大豆基因組中。以轉(zhuǎn)基因大豆籽粒的總RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板做RT-PCR，從電泳條帶的亮度上看，轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株的內(nèi)標(biāo)18SRNA含量相同，而內(nèi)源脂肪氧化酶mRNA的含量明顯降低。 4.以T1代轉(zhuǎn)

7、化的籽粒為材料，采用紫外分光光度法對脂肪氧化酶活性進行了測定，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)pC1301LoxRi質(zhì)粒大豆的脂肪氧化酶活性分別為降低62％，轉(zhuǎn)化pC1301LoxiRi質(zhì)粒大豆的脂肪氧化酶活性減低74％。說明外源基因的導(dǎo)入有效地抑制了脂肪氧化酶基因的表達(dá)。 5.以T1代轉(zhuǎn)化的籽粒為材料，采用SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化pC1301LoxRi質(zhì)粒大豆的脂肪氧化酶含量比對照平均降低55％，轉(zhuǎn)化pC1301LoxiRi質(zhì)粒大豆的脂

8、肪氧化酶含量比對照平均降低71％。 6.以T1代轉(zhuǎn)化的籽粒為材料，轉(zhuǎn)基因植株蛋白質(zhì)的凱氏定氮和索氏提取測定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株蛋白質(zhì)含量均有所下降，脂肪含量均有所上升：其中轉(zhuǎn)化pC1301LoxRi質(zhì)粒植株蛋白質(zhì)含量平均為36.06％，比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战档?.95個百分點(非轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)含量37.01％)，最大降低1.28百分點達(dá)到35.73％，脂肪平均含量23.89％，比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌骄岣吡?.74個百分點(非轉(zhuǎn)基因脂肪含量2

9、3.15％)，最大提高1.09個百分點，達(dá)到24.24％；轉(zhuǎn)pC1301LoxiRi質(zhì)粒植株蛋白質(zhì)含量平均為35.63％，比非轉(zhuǎn)基因植株對照降低了1.38個百分點(非轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)含量37.01％)，最大降低1.62百分點達(dá)到35.39％，脂肪平均含量24.33％，比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌骄岣吡?.18個百分點(非轉(zhuǎn)基因脂肪含量23.15％)，最大提高1.61個百分點，達(dá)到24.76％。 7.觀察T1代轉(zhuǎn)化植株的主要農(nóng)藝形狀，包括：株高

10、、節(jié)數(shù)、結(jié)莢數(shù)、單株粒數(shù)、蟲食粒、百粒重，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢o明顯差別。 8.對轉(zhuǎn)基因植株T2代的PCR分析及PCR-Southern結(jié)果證明：外源基因在轉(zhuǎn)基因后代中能遺傳。其分離比基本符合孟德爾的遺傳規(guī)律。 9.探討了應(yīng)用重組PCR構(gòu)建植物基因RNA干擾構(gòu)件，初步證明其是一種簡便、快捷、可行、適用范圍廣的方法。 10.初步探討了大豆花粉管通道法的室內(nèi)轉(zhuǎn)化條件，證明在我國北方地區(qū)采用花粉管通道法轉(zhuǎn)化大豆

11、可以在室內(nèi)進行，每年可以加代一次。 本項研究首次將RNA干擾技術(shù)應(yīng)用于改良大豆脂肪氧化酶含量，取得了良好效果，獲得了脂肪氧化酶含量明顯降低，脂肪含量明顯提高的轉(zhuǎn)基因大豆植株，突破了傳統(tǒng)育種方法在改良大豆品質(zhì)方面易受種質(zhì)資源限制和育種時間長的缺點，為應(yīng)用RNA干擾技術(shù)改良大豆品質(zhì)提高大豆油份含量探索了新的途徑，實現(xiàn)了大豆品質(zhì)改良育種和高油育種的方法創(chuàng)新，也為以后通過RNA干擾技術(shù)改良大豆其它營養(yǎng)抑制因子，提高大豆品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)，具