細(xì)胞培養(yǎng)常用器材與試劑

1、1器材與試劑器材與試劑干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素.純凈水系統(tǒng)、電子天平、純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計(jì)、磁力攪拌器等計(jì)、磁力攪拌器等具體步驟具體步驟1.水：水：細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水.2.PBS(也可用于其它也可用于其它BSS，如：，如：Hank

2、s，DHanks液的配制液的配制)：主要用于免疫組化染色時組織或細(xì)胞的漂洗主要用于免疫組化染色時組織或細(xì)胞的漂洗溶解定容：將藥品（溶解定容：將藥品（NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4H2O1.56g，KH2PO40.2g）倒）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至1000ml，搖勻，搖勻即成新配制的即成新配制

3、的PBS溶液。用溶液。用HCl或NaOH調(diào)PH到7.4。移入溶液瓶內(nèi)待消毒：將移入溶液瓶內(nèi)待消毒：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。3.胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組

4、織或者細(xì)胞對胰酶的作用反應(yīng)胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關(guān)，在不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關(guān)，在pH為8.0、溫度為、溫度為37℃時，胰酶時，胰酶溶液的作用能力最強(qiáng)。使用胰酶時，應(yīng)把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細(xì)胞損傷。因溶液的作用能力最強(qiáng)。使用胰酶時，應(yīng)把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造

5、成細(xì)胞損傷。因Ca2、Mg2和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時應(yīng)選用不含和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時應(yīng)選用不含Ca2、Mg2的BSS，如：，如：DHanks液。終止消化時，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細(xì)胞的作用。液。終止消化時，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細(xì)胞的作用。稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25％，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒

6、杯中的雙蒸水（若％，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào)用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右）或左右）或PBS（Dhanks）液中。攪拌混勻，置于）液中。攪拌混勻，置于4℃內(nèi)過夜。內(nèi)過夜。用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺內(nèi)用注射濾器（用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于然后分裝成小瓶于20℃保存以備使用。保存以備使

7、用。4.0.05％胰蛋白酶－％胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液溶液稱取胰蛋白酶粉末（稱取胰蛋白酶粉末（1：250）0.05g，EDTA0.02g，加入，加入PBSA100ml，0.22um微孔濾微孔濾膜過濾除菌，分裝，于－膜過濾除菌，分裝，于－20℃保存。保存。5.青、鏈霉素溶液：青、鏈霉素溶液：所用純凈水（雙蒸水）需要所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓磅高壓20分鐘滅菌。分鐘滅菌。具體操作均在超凈臺內(nèi)完成。青霉素是具體操作均在超凈臺內(nèi)

8、完成。青霉素是80萬單位萬單位瓶，用注射器加瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬單位萬單位瓶，加瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升滅菌雙蒸水，即每毫升各為各為20萬單位。萬單位。分裝于－分裝于－20℃保存。使用時溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為保存。使用時溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為100單位單位ml。6.RPMI1640：溶解、調(diào)溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積值、定容：先將

9、培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積23的雙蒸水中的雙蒸水中并用雙蒸水沖洗包裝袋并用雙蒸水沖洗包裝袋23次(沖洗液一并加入培養(yǎng)基中沖洗液一并加入培養(yǎng)基中)充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙獬浞謹(jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙獠凑瞻b說明添加一定的藥品并按照包裝說明添加一定的藥品.然后用注然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml使青鏈霉素的濃度最終各為使青鏈霉素的濃度最終各為100單位單位ml。然后用。然后用二氧化碳或碳

10、酸氫鈉調(diào)二氧化碳或碳酸氫鈉調(diào)PH到7.2左右。最后定容至左右。最后定容至1000ml，搖勻。，搖勻。安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。支架腿分別用布包好待消毒。抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內(nèi)過濾。抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌

11、。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內(nèi)過濾。3稱取稱取KH2PO40.06g，Nacl8.0g，NaHCO30.35g，KCl0.4g，葡萄糖，葡萄糖1.0g，Na2HPO4.H2O0.06g，加，加H2O至1000ml注：注：Hanks液可以高壓滅菌。分裝于液可以高壓滅菌。分裝于4℃下保存。下保存。14.Dhanks液：液：1液：液：NaCL:8.00gL，KCL:0.04gL，Na2HPO4.2H2O:0.06gL，KH2PO4:0.06g

12、L，配，配500毫升；毫升；2液：液：NaHCO3：0.35gL，配，配100毫升；毫升；3液：酚紅：液：酚紅：0.02g，用數(shù)滴，用數(shù)滴NaHCO3溶解酚紅溶解酚紅將2，3液移入液移入1液中。定容到液中。定容到1000毫升毫升PH值是值是7.4左右。分裝于左右。分裝于4℃下保存。下保存。15.Giemsa染液：染液：稱Giemsa粉末粉末0.5克，加幾滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油總量為克，加幾滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘

13、油總量為33ml）。56℃中保中保溫90~120分鐘。加入分鐘。加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存，此為甲醇，置棕色瓶中保存，此為Giemsa原液。原液。使用時按要求用使用時按要求用PBS稀釋。一般稀釋釋。一般稀釋10倍。倍。器材與試劑器材與試劑干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素.純凈水系統(tǒng)、電子天平、純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計(jì)、磁力攪拌器等計(jì)、磁力攪拌器等具體步驟具體步驟1.水：水：細(xì)胞培養(yǎng)用

14、水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水.2.PBS(也可用于其它也可用于其它BSS，如：，如：Hanks，DHanks液的配制液的配制)：主要用于免疫組化染色時組織或細(xì)胞的漂洗主要用于免疫組化染色時組織或細(xì)胞的漂洗溶解定容：將藥品（溶解定容：將藥品（NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4H2O1.56g，KH

15、2PO40.2g）倒）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至1000ml，搖勻，搖勻即成新配制的即成新配制的PBS溶液。用溶液。用HCl或NaOH調(diào)PH到7.4。移入溶液瓶內(nèi)待消毒：將移入溶液瓶內(nèi)待消毒：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入

16、高壓鍋內(nèi)8磅消毒磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。3.胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對胰酶的作用反應(yīng)胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關(guān)，在不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作

17、用時間有關(guān)，在pH為8.0、溫度為、溫度為37℃時，胰酶時，胰酶溶液的作用能力最強(qiáng)。使用胰酶時，應(yīng)把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細(xì)胞損傷。因溶液的作用能力最強(qiáng)。使用胰酶時，應(yīng)把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細(xì)胞損傷。因Ca2、Mg2和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時應(yīng)選用不含和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時應(yīng)選用不含Ca2、Mg2的BSS，如：，如：DHanks液。終止消化時，可用含有

18、血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細(xì)胞的作用。液。終止消化時，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細(xì)胞的作用。稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25％，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若％，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào)用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右）或左右）或PBS（Dhanks）液中。攪拌混勻，置于）液中。攪拌混勻，置于4℃內(nèi)過夜。內(nèi)過夜。用注射濾器抽

19、濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺內(nèi)用注射濾器（用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于然后分裝成小瓶于20℃保存以備使用。保存以備使用。4.0.05％胰蛋白酶－％胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液溶液稱取胰蛋白酶粉末（稱取胰蛋白酶粉末（1：250）0.05g，EDTA0.02g，加入，加入PBSA100ml，0.22um微孔濾微孔濾膜過濾除菌，分裝，