質(zhì)粒載體介紹

1、質(zhì)粒載體介紹（質(zhì)?；咎匦院头N類及標(biāo)記基因）一、質(zhì)粒的基本特性一、質(zhì)粒的基本特性1質(zhì)粒的復(fù)制通常一個(gè)質(zhì)粒含有一個(gè)與相應(yīng)的順式作用控制要素結(jié)合在一起的復(fù)制起始區(qū)（整個(gè)遺傳單位定義為復(fù)制子）。在不同的質(zhì)粒中，復(fù)制起始區(qū)的組成方式是不同的，有的可決定復(fù)制的方式，如滾環(huán)復(fù)制和θ復(fù)制。在大腸桿菌中使用的大多數(shù)載體都帶有一個(gè)來(lái)源于pMB1質(zhì)?；駽olE1質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)。圖31是其復(fù)制其始示意圖。在復(fù)制時(shí)，首先合成前RNAⅡ，即前引物，并與DNA

2、形成雜交體；而后RNaseH切割前RNAⅡ，使之成為成熟的RNAⅡ，并形成三葉草二級(jí)結(jié)構(gòu)，該引物引導(dǎo)質(zhì)粒的復(fù)制。形成的RNAⅠ可控制RNAⅡ形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí)Rop增強(qiáng)RNAⅠ的作用，從而控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)。削弱RNAⅠ和RNAⅡ之間相互作用的突變，將增加帶有pMB1或（ColE1）復(fù)制子的拷貝數(shù)。圖31帶pMB1（或ColE1）復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒在復(fù)制起始階段所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄的方向及其粗略大小。2質(zhì)粒的拷貝數(shù)質(zhì)?？截悢?shù)分為嚴(yán)謹(jǐn)型與松馳型。嚴(yán)謹(jǐn)型

3、質(zhì)粒每個(gè)細(xì)胞中拷貝數(shù)有限，大約1～幾個(gè)；松馳型質(zhì)?？截悢?shù)較多，可達(dá)幾百。表51就是不同類的質(zhì)粒與復(fù)制子及拷貝數(shù)的大致關(guān)系。表3131：質(zhì)粒載體及其拷貝數(shù)：質(zhì)粒載體及其拷貝數(shù)質(zhì)粒質(zhì)粒復(fù)制子復(fù)制子拷貝數(shù)拷貝數(shù)pBR322及其衍生質(zhì)粒pMB115～20pUC系列質(zhì)粒及其衍生質(zhì)粒突變的pMB1500～700pACYC及其衍生質(zhì)粒p15A10～212pSC101及其衍生質(zhì)粒pSC101～5ColE1ColE115～20pUC系列質(zhì)粒的復(fù)制單位來(lái)自

4、質(zhì)粒pMB1，但其拷貝數(shù)較高。pMB1質(zhì)粒的復(fù)制并不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期較長(zhǎng)的酶（DNA聚合酶Ⅰ，DNA聚合酶Ⅲ），依賴于DNA的RNA聚合酶，以及宿主基因dnaB、dnaC、dnaD和danZ的產(chǎn)物。因此，存在抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制的氯霉素或壯觀霉素等抗生素時(shí)，帶有pMB1（或ColE1）復(fù)制子的質(zhì)粒將繼續(xù)復(fù)制，最后每個(gè)細(xì)胞中可積聚2～3千個(gè)質(zhì)粒。3質(zhì)粒的不相容性兩個(gè)質(zhì)粒在同一宿主中不能共存

5、的現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性，它是指在第二個(gè)質(zhì)粒導(dǎo)入后，在不涉及DNA限制系統(tǒng)時(shí)出現(xiàn)的現(xiàn)象。不相容的質(zhì)粒一般都利用同一復(fù)制系統(tǒng)，從而導(dǎo)致不能共存于同一宿主中。兩個(gè)不相容性質(zhì)粒在同一個(gè)細(xì)胞中復(fù)制時(shí)，在分配到子細(xì)胞的過(guò)程中會(huì)競(jìng)爭(zhēng)，隨機(jī)挑選，微小的差異最終被放大，從而導(dǎo)致在子細(xì)胞中只含有其中一種質(zhì)粒。而不相容群指那些具有不相容性的質(zhì)粒組成的一個(gè)群體，一般具有相同的復(fù)制子。在大腸桿菌中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)30多個(gè)不相容群，如ColE1和pMB1，pSC101和p

6、15A。4轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒具轉(zhuǎn)移性。它是指在自然條件下，很多質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)稱為細(xì)菌接合的作用轉(zhuǎn)移到新宿主內(nèi)。它需要移動(dòng)基因mob，轉(zhuǎn)移基因tra，順式因子bom及其內(nèi)部的轉(zhuǎn)移缺口位點(diǎn)nic。二、標(biāo)記基因二、標(biāo)記基因按其用途可將標(biāo)記基因分為選擇標(biāo)記基因和篩選標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記用于鑒別目標(biāo)DNA（載體）的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來(lái)，篩選標(biāo)記可用于將特殊表型的重組子挑選出來(lái)。用的底物。異丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖的衍生物，可作為

7、lac操縱子的誘導(dǎo)物，但不能作為反應(yīng)的底物；5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷（Xgal）可作為lac操縱子的底物，但不能作為誘導(dǎo)物。底物Xgal還可充作生色劑，被β半乳糖苷酶分解后可產(chǎn)生蘭色產(chǎn)物，可使菌落或噬菌斑呈蘭色。2插入失活通過(guò)插入失活進(jìn)行篩選的質(zhì)粒主要有pBR322，該質(zhì)粒具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr）兩種抗性標(biāo)記。當(dāng)外源DNA片段插入tetr基因后，導(dǎo)致tetr基因失活，變成只對(duì)氨芐青霉素有抗性。這樣

8、就可通過(guò)對(duì)抗生素是雙抗還是單抗來(lái)篩選是否有外源片段插入到載體中。三、質(zhì)粒載體的種類三、質(zhì)粒載體的種類（一）克隆載體克隆載體主要用于擴(kuò)增或保存DNA片段，是最簡(jiǎn)單的載體。1pBR322pBR322質(zhì)粒的大小為4361bp，GenBank注冊(cè)號(hào)為V0lll9和J01749，含有30多個(gè)單一位點(diǎn)，具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr），其質(zhì)粒復(fù)制區(qū)來(lái)自pMB1（如圖33）。目前使用廣泛的多質(zhì)粒載體幾乎都是由此發(fā)展而來(lái)的

9、。利用四環(huán)素抗性基因內(nèi)部的BamHⅠ位點(diǎn)來(lái)插入外源DNA片段，可通過(guò)插入失活進(jìn)行篩選。2pUC18和pUC19pUC18和pUC19大小只有2686bp，是最常用的質(zhì)粒載體，其結(jié)構(gòu)組成緊湊，幾乎不含多余的DNA片段，GenBank注冊(cè)號(hào)為L(zhǎng)08752（pUC18）和X02514（pUC19）。由pBR322改造而來(lái)，其中l(wèi)acZ（MSC）來(lái)自M13mp1819圖34是其質(zhì)粒圖譜。這兩個(gè)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)幾乎是完全一樣的，只是多克隆位點(diǎn)的排列方向