kras和egfr檢測與臨床應(yīng)用

1、,匯報(bào)內(nèi)容,KRAS和EGFR的簡介及臨床意義ARMS-PCR的基本原理和技術(shù)特點(diǎn)等位特異性引物設(shè)計(jì)KRAS試劑盒開發(fā)簡介,,KRAS和EGFR的簡介及臨床意義,,KRAS背景,KRAS是一種原癌基因，長約35kb，位于12號(hào)染色體，是RAS基因家族成員之一，編碼的蛋白主要參與PI3K、PTEN、AKT和RAF、MEK、ERK信號(hào)通路的調(diào)控；EGFR在通路中位于KRAS上游，配體與之結(jié)合后可以激發(fā)其酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致KRAS的

2、活化和通路中信號(hào)傳導(dǎo)；KRAS是許多惡性腫瘤的常見突變基因：胰腺癌（65%-90%）、結(jié)直腸癌（40%）、肺癌（20%）、卵巢癌（15%）。,,KRAS基因突變影響結(jié)直腸癌藥物療效,KRAS基因野生型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者能從EGF抗體（西妥昔單抗、帕尼單抗）治療中獲益，而基因突變的患者治療效果很差；,KRAS突變型患者對西妥昔單抗無應(yīng)答，其總體生存期明顯低于KRAS野生型患者,Karapetis CS, 2008, N Eng J M

3、ed,結(jié)直腸癌患者檢測KRAS突變相關(guān)指南,歐洲藥品評估局（EMEA，2008）指出：KRAS野生型的進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者可能從帕尼單抗中受益，而突變型患者受益較少。美國臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO，2009）推薦：轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者應(yīng)檢測KRAS突變，如有KRAS12、13位突變，則不應(yīng)進(jìn)行EGFR單克隆抗體治療；美國FDA指南推薦：在使用靶向藥物西妥昔單抗和帕尼單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌前必須檢測KRAS基因的基因型；2012年7月6日批

4、準(zhǔn)第一個(gè)用于結(jié)直腸癌的基因檢測（Qiagen），以判斷西妥昔單抗是否有效；美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN，2014）指南說：轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者均應(yīng)進(jìn)行RAS突變檢測（KRAS和NRAS），至少應(yīng)檢測KRAS第二外顯子的突變情況。KRAS或NRAS突變型的病人不應(yīng)采取西妥昔單抗或帕尼單抗治療。中國衛(wèi)生部于2010年10月14日發(fā)表了《結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2010版）》 。明確指出在患者確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌接受西妥昔單抗、帕尼單抗時(shí)

5、，必須檢測腫瘤組織的K-ras基因狀態(tài)。在晚期/轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療中，在治療前檢測腫瘤 K-ras 基因狀態(tài)，EGFR不推薦作為常規(guī)檢查項(xiàng)目。,,KRAS基因突變影響非小細(xì)胞肺癌藥物療效,KRAS基因野生型的非小細(xì)胞肺癌患者能從小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI，如吉非替尼、厄洛替尼）治療中獲益，而基因突變的患者易發(fā)生抵抗；,KRAS突變型患者使用厄洛替尼聯(lián)合化療后，其無癥狀生存期和總生存期明顯低于野生型患者（圖中紅線所示）,Anderso

6、n SM, 2011, Expert Rev. Mol. Diagn Eberhard DA, 2005, J Clin Oncol,,非小細(xì)胞肺癌患者檢測KRAS突變相關(guān)指南,美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN，2009）指出，KRAS突變與非小細(xì)胞肺癌患者TKI抵抗有關(guān)，KRAS基因測序有助于確定哪些病人適合TKI治療。當(dāng)KRAS基因發(fā)生了突變，則不建議病人使用厄洛替尼進(jìn)行分子靶向治療。,,KRAS主要突變位點(diǎn),在結(jié)直腸癌中，KRAS

7、突變主要發(fā)生于codon12 (80%)、codon13 (15-20%)、codon61和146 (<5%)；在肺癌中，約97%的KRAS突變發(fā)生于codon12、13，其余位于codon61和146。,,EGFR突變背景,EGFR基因位于染色體7p11.2，大小約200kb，是上皮生長因子（EGF）細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)的受體。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相關(guān)信號(hào)通路中關(guān)鍵因子的活性或細(xì)胞定位異常，與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管

8、生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。非小細(xì)胞肺癌中EGFR突變率在北美和西歐為10%左右，而在東亞為30-50%。其中在亞洲、女性、非吸煙、腺癌患者中EGFR突變率最高，達(dá)70-80%。,,EGFR突變背景,研究發(fā)現(xiàn)EGFR突變與吉非替尼、厄洛替尼的療效密切有關(guān)。其中EGFR突變的患者對吉非替尼、厄洛替尼治療敏感，有效率在80%以上；而EGFR野生型的患者的有效率在10%以下。吉非替尼、厄洛替尼作為一線藥物治療非小細(xì)胞肺癌，相

9、比傳統(tǒng)的化療可以取得更長的無進(jìn)展生存期（PFS），且副作用相對較小，患者容易耐受，但總體生存期（OS）并未延長。EGFR-TKI目前主要用于非小細(xì)胞肺癌一線、二線和維持治療。我國大部分醫(yī)生將其用于二線（69.4%）治療，41.7%的醫(yī)生將其用于一線治療，27.8%的醫(yī)生將其作為維持治療藥物。,,EGFR突變影響肺癌藥物療效,研究表明EGFR突變型患者使用吉非替尼的療效要優(yōu)于卡鉑與紫杉醇組合治療，而在野生型患者中則相反，使用吉非替尼的療

10、效不如卡鉑與紫杉醇組合治療。,Mok T.S. 2009, N Eng J MedMaemondo M. 2010, N Eng J Med,,EGFR突變檢測相關(guān)指南,美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)2011版的癌癥治療指南中明確指出： EGFR突變，尤其是外顯子19的缺失突變和外顯子21的L858R突變，與腫瘤對TKIs如吉非替尼治療敏感性有重要關(guān)系。而部分EGFR-TKI初始治療有效的患者后期會(huì)發(fā)生耐藥，與EGFR外顯子20突變

11、密切相關(guān)。美國臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO）在JCO上發(fā)表報(bào)告：EGFR-TKI是攜帶EGFR突變型的非小細(xì)胞肺癌病人的一線治療藥物，有益于進(jìn)展期非小細(xì)胞肺癌患者的個(gè)體化治療。歐洲EMEA指出：易瑞沙（吉非替尼）僅對攜帶EGFR突變型的非小細(xì)胞肺癌患者有效，平均無進(jìn)展生存期延長3.5月。美國FDA（2013）批準(zhǔn)對擬采用阿法替尼、厄洛替尼等EGFR-TKI治療的患者進(jìn)行EGFR突變檢測的試劑盒（therascreen EGFR RGQ

12、PCR Kit和 cobas® EGFR Mutation Test）；我國《非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南》中也明確指出EGFR突變，尤其是19號(hào)外顯子缺失突變與腫瘤對酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)的敏感度有重要關(guān)系；對腺癌、大細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌等肺癌組織學(xué)類型，EGFR檢測為一類推薦。,,EGFR突變位點(diǎn)（常規(guī)檢測29個(gè)）,,EGFR突變與EGFR-TKI藥物療效關(guān)系,,ADx EGFR試劑盒突變結(jié)果檢測,,ARMS-PCR的

13、基本原理和技術(shù)特點(diǎn),,ARMS-PCR原理,ARMS是Amplification Refractory Mutation System (擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng))的縮寫。根據(jù) PCR過程中要求引物和模板間的嚴(yán)格互補(bǔ)配對來實(shí)現(xiàn)對突變位點(diǎn)的檢測, 當(dāng)引物 3′ 末端出現(xiàn)錯(cuò)配時(shí), 產(chǎn)物將不能延伸。因此設(shè)計(jì)兩條上游（或下游）引物，使其3′末端分別與突變位點(diǎn)堿基匹配和錯(cuò)配，共用下游（或上游）引物，分別擴(kuò)增野生型和突變型目的片斷。,,ARMS-PCR

14、原理,Two Allele-Specific (AS) primers, one for each allele of a SNP are designed. The AS primers contain one of two polymorphic nucleotides at the primer 3' end. Two sets of primers, either forward or reverse primers c

15、an be designed. If a common reverse or forward primer is used in a PCR reaction, the reaction is called allele-specific PCR (AS-PCR).,You F. M. 2008, BMC Bioinformatics,,PCR產(chǎn)物檢測--Real time PCR,每個(gè)PCR循環(huán)檢測熒光信號(hào)，不同PCR產(chǎn)物，不同熒光信

16、號(hào)相比凝膠電泳：更快，可定量，無PCR產(chǎn)物污染信號(hào)產(chǎn)生方法：Scorpion (Qiagen)，雙環(huán)探針(廈門艾德)，Taqman，Molecular beacons，Sybr green，Yo-pro,Figure 2 The sensitivity of QuanTAS-PCR for quantifying JAK2 mutant alleles.,Zapparoli G. V. 2013, BMC Cancer,,應(yīng)用于Re

17、al time-PCR的ARMS-PCR,,ARMS技術(shù)特點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高（0.1-1%）操作簡便周期短不產(chǎn)生PCR產(chǎn)物污染適用樣本類型多（如FFPE）精確突變類型,缺點(diǎn)：方法建立需時(shí)較長僅能檢測已知突變,,測序法與ARMS法相比較,,操作流程及數(shù)據(jù)解讀,,檢測流程與質(zhì)量控制,標(biāo)本準(zhǔn)備,,DNA抽提,,突變檢測,,分析報(bào)告,標(biāo)本種類標(biāo)本量,SOPOD 260/280 （新鮮組織）qPCR （FFPE）

18、,SOP陽性及陰性對照問題及解決,SOP報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)判讀形式及檢查,,使用ARMS的KRAS突變檢測試劑盒,,使用ARMS的EGFR突變檢測試劑盒,,等位特異性引物設(shè)計(jì),,KRAS基因序列和常見突變,KRAS序列：ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAG

19、GATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG常見突變：,,三引物設(shè)計(jì)原理,You F. M. 2008, BMC Bioinformatics,,三引物設(shè)計(jì),ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGT

20、GGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG野生型引物（F）5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3’ 19nt，51℃突變型引物（F）5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3’19nt，49℃下游引物（R）5’-CCTCTATTGTTGGAT

21、CATATTCGTC-3’25nt，54℃,,三引物設(shè)計(jì)—下游引物設(shè)計(jì),ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAA

22、GAG選擇序列：5’-GACGAATATGATCCAACAATAGAGG-3’互補(bǔ)鏈：3’- CTGCTTATACTAGGTTGTTATCTCC-5’下游引物：5’- CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC -3’,,3’端增加錯(cuò)配,如果3’端是弱錯(cuò)配（C/A或G/T）則需要引入強(qiáng)的錯(cuò)配（A/G或C/T）才可阻斷3’端的擴(kuò)增；如果3’端是強(qiáng)錯(cuò)配（A/G或C/T）則需要引入弱的錯(cuò)配（C/A或G/T）或不需引入

23、錯(cuò)配即可阻斷3’端的擴(kuò)增；當(dāng)3’端是中度錯(cuò)配（A/A，C/C，G/G 或T/T）則需要引入中度的錯(cuò)配。野生型引物（F）5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3’ 突變型引物（F）5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCCT-3’下游引物（R）5’-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3’,,四引物設(shè)計(jì),,四引物設(shè)計(jì),ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGG

24、TGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG內(nèi)引物（F）5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3’ 內(nèi)引物（R）5’-ACTCTTGCCTACGCCACC-3’外

25、引物（F）5’-ATGACTGAATATAAACT-3’外引物（R）5’-CTCTTGACCTGCTGTGTCG-3’,,KRAS試劑盒開發(fā)簡介,,KRAS突變探針和引物設(shè)計(jì),KRAS序列：ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACA

26、GGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG1. 5’-CTT GTG GTA GTT GGA GCT TA-3’ 12GGT — GAT 2. 5’- AAA CTT GTG GTA GTT GGA GCG GT-3’ 12GGT — GTT3. 5’

27、- AA CTT GTG GTA GTT GGA GCT GC-3’ 12GGT — GCT4. 5’- ATAAA CTT GTG GTA GTT GGA GCT A-3’ 12GGT — AGT5. 5’- AA CTT GTG GTA GTT GGA GCG T-3’ 12GGT — TGT6. 5’- ATAAA CTT GTG GTA GTT GG

28、A GCC C-3’ 12GGT — CGT7. 5’- GTG GTA GTT GGA GCT GGT AA-3’ 13GGC — GAC8. 參照引物：5’-CT GAA TAT AAA CTT GTG GTA GTT-3’9. 下游引物：5’-ACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3’ TaqMan探針：5’-FAM-TCTGAATTAG

29、CTGTATCGTCAAGGCACTCT-BHQ1-3’鎖核酸阻滯探針(野生型)： 5’-T GGA GCT GGT GGC GTA GGC-P04-3’,浙江大學(xué)，CN 102367478 B,,反應(yīng)體系,引物終濃度：0.3 μMTaqman探針終濃度：0.1 μMLNA阻滯探針終濃度：0.9 μMGoldstarbest Taq酶終濃度：0.05 U/μl 模板DNA終濃度：10-300 ng/μldNTP

30、s終濃度：0.2 mMMgCl2 終濃度：3.5 mM,Real time-PCR循環(huán):95°C預(yù)變性10分鐘95°C 15秒60°C 40秒擴(kuò)增反應(yīng)40循環(huán)，60°C 40秒,ARMS-qPCR在ABI7500或LC480檢測儀上進(jìn)行。每個(gè)樣本進(jìn)行8管反應(yīng)，每管反應(yīng)加入共同的qPCR混合液，LNA阻滯探針及模板DNA，所不同的只有參照引物或者ARMS引物。,,擬開發(fā)產(chǎn)品,特異性引物：

31、7條 （檢驗(yàn)特異性）參照引物：1條 （檢驗(yàn)特異性）下游引物：1條 （檢驗(yàn)特異性）Taqman探針：1條鎖核酸阻滯探針：1條陽性對照：包含7種突變的質(zhì)粒DNA模板（測序）Taq酶，最好為Taq Gold （hot start enzyme)qPCR混合反應(yīng)液,,結(jié)果判讀,參照引物管擴(kuò)增曲線陽性，各種ARMS引物管均無擴(kuò)增曲線或者其與參照引物管的擴(kuò)增曲線Ct差值 > 10，該樣本結(jié)果判斷為野生型；參照引物管