IL-10和TGF-β1基因共修飾樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝移植是目前治療終術(shù)期良性肝病的效治療手段。肝移植的理想目標(biāo)是要達(dá)到移植肝和受體之間的免疫耐受，既在低免疫抑制或無免疫抑制的情況下移植物仍然功能正常。免疫抑制劑的使用短期內(nèi)能改善急性排斥癥狀，但不能保證移植物長期存活，此外免疫抑制劑的長期使用常導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，因此我們尋找有效的在不使用免疫抑制劑的情況下，使受者機(jī)體對于移植物產(chǎn)生特異性的耐受已經(jīng)成為移植免疫學(xué)領(lǐng)域最為關(guān)注的問題方法，因此，本研究通過對樹突狀細(xì)胞及其基因工程改造，探討它們

2、與肝移植耐受的關(guān)系，從而為無限期延長移植物的存活提供新的治療方案。 在免疫耐受的誘導(dǎo)中，樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，Dc)起重要的作用，現(xiàn)在已知DC是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞(Antigen Presenting Cells,APC)，在機(jī)體的特異性免疫中起著非常重要的作用。目前研究證實(shí)，DC在啟動免疫反應(yīng)和誘導(dǎo)免疫耐受起決定性作用，這取決于其成熟狀態(tài)，不成熟DC表面缺乏或低表達(dá)MHC分子和共刺激分子，導(dǎo)致T細(xì)胞

3、的無能和低反應(yīng)，從而誘導(dǎo)抗原特異性免疫耐受，而成熟DC表面高表達(dá)Mt{C分子和共刺激分子能激活參與免疫反應(yīng)的淋巴細(xì)胞的增生，因此對DC進(jìn)行改造以誘導(dǎo)移植免疫耐受成為研究的熱點(diǎn)和關(guān)鍵領(lǐng)域。 白介素-10(interleukin-10，IL-10)可抑制Th.1激活的抗原提呈細(xì)胞合成細(xì)胞因子，阻止單核巨噬細(xì)胞活化和抗原提呈細(xì)胞的功能。因此，可以抑制炎性免疫反應(yīng)和T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。從而減輕免疫排斥反應(yīng)有很重要的意義。 轉(zhuǎn)化

4、生長因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)是一種強(qiáng)效免疫抑制因子，它可以抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的增殖和活化，抑制T，B淋巴細(xì)胞的增殖及免疫球蛋白的分泌，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子如IL-1，IL-2的生成并拮抗它們的功能。因此，它在移植免疫過程中，對移植物的長期存活和移植物的耐受密切相關(guān)。 由于IL-10和TGFβ1既是誘導(dǎo)耐受DC形成的重要細(xì)胞因子，又是參與誘導(dǎo)移植耐受的重要細(xì)胞因子，所以

5、我們通過從大鼠骨髓分離造血前體細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)足夠數(shù)量的DC，構(gòu)建IL-10和TGFβ1重組質(zhì)粒，并將其單個和聯(lián)合轉(zhuǎn)染大鼠imDC，研究IL-10和TGFβ1單個和聯(lián)合轉(zhuǎn)染后的imDC輸注后在受者體內(nèi)的遷移途徑，以及對于同種異體大鼠移植肝的排斥反應(yīng)級別和存活時間的影響，探討它們誘導(dǎo)移植耐受的機(jī)制。 目的: 通過基因工程改造DC，建立肝移植動物模型，構(gòu)建IL-10和TGβ1重組質(zhì)粒，研究IL-10和TGFβ1單個和聯(lián)合轉(zhuǎn)染

6、的DC輸注受者體內(nèi)的遷移途徑，以及對于同種異體大鼠移植肝的排斥反應(yīng)級別和存活時間的影響，探討DC誘導(dǎo)移植耐受的機(jī)制，為臨床治療移植免疫排斥提供了有力的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和有關(guān)理論上的依據(jù)。 方法: 1.DA大鼠DC的誘導(dǎo)、培養(yǎng)及鑒定：用不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)大鼠骨髓來源的造血前體細(xì)胞成為成熟DC(mature DC，mDC)和不成熟DC(immature DC，imDC)，利用電鏡等進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察鑒定、利用流式細(xì)胞法和免疫組化法進(jìn)行

7、表型鑒定，利用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)和動物體內(nèi)直接注射DC進(jìn)行功能學(xué)鑒定。 2.構(gòu)建、篩選、擴(kuò)增、抽提和鑒定plRES2-EGFP-hlL-10和plRES2-EGFP-hTGFβ1真核表達(dá)質(zhì)粒：(1)RT-PCR擴(kuò)增人IL-10基因，1％瓊脂糖凝膠電泳分離、回收PCR產(chǎn)物，含plRES2-EGFP空載體，經(jīng)XhoⅠ和EcoR Ⅰ雙酶切后，T4DNA連接酶連接，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于DH5a感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)提質(zhì)粒，以Xho

8、Ⅰ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。將雙酶切為陽性的質(zhì)粒plRES2-EGFP-hiL10送公司測序。(2)hTGFβ1構(gòu)建方法同前，以BglⅡ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切鑒定。(3)用中抽試劑盒抽提質(zhì)粒，以紫外分光光度計測定質(zhì)粒的濃度。 3.脂質(zhì)體介導(dǎo)的pIRES2-EGFP-hlL-10和pIRES2-EGFP-hTGFβ1單個和聯(lián)合轉(zhuǎn)染imDC細(xì)胞：收集培養(yǎng)6天的imDC，按照Lipofect鋤ine2000使用說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)設(shè)立

9、空載體轉(zhuǎn)染組、IL-10、TGFβ1轉(zhuǎn)染組和共轉(zhuǎn)染組，48hr熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白在imDC中的表達(dá)。 4.用5種方法檢測轉(zhuǎn)染后各組imDC分子表型和免疫功能的變化：(1)ELISA法和(2)Western Blot法檢測轉(zhuǎn)染后各組imDC培養(yǎng)上清IL-10、TGFβ1蛋白表達(dá)；(3)流式細(xì)胞法檢測各組imDC表面分子CD80、CD86表達(dá)情況； (4)免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測各組imDC MHCll分子表達(dá)情況；(5)混

10、合淋巴細(xì)胞反應(yīng)法檢測各組imDC對T細(xì)胞的增殖作用。 5.大鼠肝移植模型構(gòu)建：受體為Lewis；大鼠，供體為DA大鼠，采用二袖套法建立肝移植模型。 6.IL-10、TGFβ1單基因和聯(lián)合轉(zhuǎn)染的DC輸注對于同種異體Lewis大鼠移植肝耐受的實(shí)驗(yàn)研究： (1)探討plRES2-EGFP-DC腹腔和尾靜脈輸注后在受體Lewis體內(nèi)的遷移途徑以及微嵌合體形成的機(jī)制；(2)IL-10、TGFβ1單基因和聯(lián)合轉(zhuǎn)染的imDC移植前5d

11、輸注受體Lewis大鼠體內(nèi)，移植后分別于3d、7d、10d：1)檢測肝功能；2)E1ASA法檢測各組IL-12水平；3)肝臟蘇木精伊紅(HE)染色及急性排斥反應(yīng)病理評分；4)TUNEL法檢測肝臟、脾和淋巴結(jié)采用淋巴細(xì)胞的凋亡情況。(3)觀察各組大鼠肝移植后的生存時間。 7.統(tǒng)計學(xué)處理：應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，p<0.05為具有顯著性差異。 結(jié)論: 1.本實(shí)驗(yàn)已成功利用細(xì)胞因子從大鼠骨髓造血干細(xì)

12、胞誘導(dǎo)出足夠數(shù)量的mDC和imDC。同時，mDC和imDC具有不同的生物學(xué)特性。 2.我們在成功構(gòu)建plRES2-EGFP-hIL-10和pIRES2-EGFP-hTGFβ1真核表達(dá)質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，采用脂質(zhì)體法成功轉(zhuǎn)染imDC，可以獲得良好的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)入的基因可以在imDC內(nèi)表達(dá)，并且使imDC的生物學(xué)特性發(fā)生相應(yīng)的改變。 3.本實(shí)驗(yàn)采取基因共轉(zhuǎn)染技術(shù)，發(fā)現(xiàn)IL-10和TGFβ1共轉(zhuǎn)染對誘導(dǎo)大鼠移植免疫耐受作用和延長移植