小檗堿膽酸衍生物B4誘導(dǎo)SMMc-7721肝癌細(xì)胞凋亡機(jī)制.pdf

1、小檗堿對許多腫瘤的生長都有一定的抑制效果，包括肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、肺癌、口腔癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌等。盡管小檗堿在胃腸道中狀態(tài)穩(wěn)定，但是體內(nèi)吸收不好，導(dǎo)致血藥濃度低，生物利用度也不好，影響了對其的有效利用。為了進(jìn)一步降低小檗堿的毒性，增強(qiáng)機(jī)體對其吸收，提高其脂溶性和生物利用度，我們采用親核取代、酰胺化、酯化等方法將小檗堿與膽酸進(jìn)行偶聯(lián)，探索了不同膽酸取代基在小蘗堿不同取代位置對其生物活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)，眾多新生衍生物中，通過酯鍵將

2、鵝脫氧膽酸連接到小檗堿的C-9位上合成出的2，3-Methenedioxy-9-O-(3'α，7'α-dihydroxy-5'β-cholan-24'-propy-lester) berberine(B4)，有較高的生物利用度，是小檗堿的4.7倍，同時具有有顯著的抗菌活性，對許多腫瘤細(xì)胞都具有顯著的增值抑制作用，包括肝癌細(xì)胞(SMMC-7721，BEL-7402)、胃癌細(xì)胞(SGC-7901)、結(jié)腸癌(HCT-116)等，其中對肝癌SM

3、MC-7721細(xì)胞的外抗腫瘤作用效果最顯著，具有良好的開發(fā)前景。本論文主要借助細(xì)胞平臺，運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)手段，包括流式細(xì)胞術(shù)、激光共聚焦顯微鏡、瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)以及Western Blot蛋白印記等實(shí)驗(yàn)方法研究了B4誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測B4對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用以及對人正常肝HL-7702細(xì)胞的毒性大小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明B4對SMMC

4、-7721細(xì)胞的增殖抑制效果明顯強(qiáng)于小檗堿，并且呈現(xiàn)一定的時間和濃度上的依賴性;B4對HL-7702正常肝細(xì)胞的毒副作用要遠(yuǎn)小于小檗堿，在0.4μM～2μM實(shí)驗(yàn)濃度下，B4對正常細(xì)胞的最大抑制率小于20％，毒性很小，因此將2μM作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最大給藥濃度。
　　觀察B4作用SMMC-7721細(xì)胞后其形態(tài)學(xué)特征變化主要是通過激光共聚焦顯微鏡(LSCM)，結(jié)果表明2μMB4孵育SMMC-7721細(xì)胞48 h后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著的變化，

5、細(xì)胞核縮皺并且邊緣化，核仁破碎裂解，產(chǎn)生凋亡小體。
　　通過流式細(xì)胞儀分析B4誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生凋亡和對細(xì)胞周期阻滯的影響。不同藥物濃度處理SMMC-7721細(xì)胞48 h后，隨著給藥濃度的增加，處于G0/G1期和G2/M期細(xì)胞數(shù)不斷減少，而S期細(xì)胞數(shù)不斷增加，這表明B4能夠誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞生長周期阻滯于S期。此外凋亡結(jié)果顯示B4作用SMMC-7721細(xì)胞后，隨著給藥濃度的增加，細(xì)胞凋亡率也逐漸增加并且呈現(xiàn)一定

6、的濃度依賴性，但是小檗堿作用后，SMMC-7721細(xì)胞的凋亡率卻很低，表明B4對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用要顯著于小檗堿。
　　流式細(xì)胞檢測B4誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)ROS水平、Ca2+濃度和線粒體膜電位（△Ψm）的變化，發(fā)現(xiàn)隨著給藥濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)Ca2+、ROS的水平也逐漸增加，細(xì)胞△Ψ m卻逐漸降低。為進(jìn)一步研究ROS在B4誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡過程中起到的重要作用，我們在B4處理細(xì)胞之前，先

7、用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)預(yù)處理細(xì)胞1h，再用SMMC-7721細(xì)胞孵育48 h。結(jié)果顯示在一定的給藥濃度范圍內(nèi)，NAC阻止了B4誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+、ROS水平的升高以及細(xì)胞△Ψm的降低，表明ROS能夠調(diào)控B4誘導(dǎo)的SMMC-7721細(xì)胞凋亡。
　　Western Blot法主要分析了B4作用SMMC-7721細(xì)胞后常見的凋亡相關(guān)蛋白水平的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)B4能誘導(dǎo)聚ADP-核糖聚合酶(PARP)裂解產(chǎn)物增加以及ca

8、spase家族蛋白的活化，同時B4誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)蛋白從線粒體易位到胞核，促使核內(nèi)的DNA大量片段化，這表明B4可能通過激活caspase依賴性和非依賴性的細(xì)胞凋亡通路使部分人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡。此外，用抗氧化劑NAC抑制活性氧(ROS)的活性后，B4引起的細(xì)胞生長抑制、誘導(dǎo)凋亡作用均被減弱，這提示B4誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡與細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增加有關(guān)，為進(jìn)一步將B4應(yīng)用于肝癌的臨床治療提供一定的依據(jù)。<