重組產(chǎn)氣腸桿菌提高產(chǎn)氫效率的研究.pdf

1、隨著環(huán)保要求的迫切和化石能源的日益短缺，氫能作為清潔高效的可再生能源受到人們的普遍重視。目前通過基因工程和代謝調(diào)控手段改造產(chǎn)氫生物，是生物制氫領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文以高效產(chǎn)氫細(xì)菌產(chǎn)氣腸桿菌EnterobacteraerogenesATCC13408為主要研究對(duì)象，對(duì)其產(chǎn)氫代謝途徑中的相關(guān)基因進(jìn)行了以下研究： 克隆陰溝腸桿菌E.cloacaeIIT-BT08的鐵氫酶hydA基因，并在大腸桿菌E.coliBL21、產(chǎn)氣腸桿菌E.ae

2、rogenesATCC13408和陰溝腸桿菌E.cloacaeCICC10017中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，重組后細(xì)菌的產(chǎn)氫量均有不同程度的提高：使原本不產(chǎn)氫的E.coliBL21氫氣產(chǎn)量達(dá)到0.5molH2/mol葡萄糖，使產(chǎn)氣腸桿菌的氫氣產(chǎn)量從原菌的1.19molH2/mol葡萄糖提高到2.31molH2/mol葡萄糖，使陰溝腸桿菌的氫氣產(chǎn)量從原菌的1.286H2/mol葡萄糖提高到2.545molH2/mol葡萄糖。 fhlA基因是

3、產(chǎn)氣腸桿菌甲酸，氫裂解酶系統(tǒng)FHL的轉(zhuǎn)錄激活蛋白，本文通過設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并性引物和genomicwalking技術(shù)，成功克隆了fhlA基因，完整的ORF全長(zhǎng)2073bp，編碼690個(gè)氨基酸。FhlA成功地在產(chǎn)氣腸桿菌中實(shí)現(xiàn)過量表達(dá)，重組后的細(xì)菌的產(chǎn)氫能力由原菌的1.23molH2/mol葡萄糖提高到了1.48molH2/mol葡萄糖，提高了20.36％。 產(chǎn)氣腸桿菌氫酶屬于典型的[NiFe]氫酶，由多亞基共同組成。本文擴(kuò)增出E.aer

4、ogenesATCC13408的hyc操縱子全長(zhǎng)，共有9個(gè)亞基的ORF，其中HycE、HycG分別編碼氫酶的大、小亞基，hycE和hycG基因的過量表達(dá)使產(chǎn)氣腸桿菌的底物產(chǎn)氫潛力由1.14molH2/mol葡萄糖提高到了2.05molH2/mol葡萄糖和2.08molH2/mol葡萄糖，分別提高了80.1％和82.65％。 藍(lán)藻Synechocystissp.PCC6803的hoxEFUYH基因全長(zhǎng)6493bp，由E、F、U、

5、Y、H共5個(gè)亞基組成一個(gè)NAD-還原型氫酶操縱子。本文克隆了藍(lán)藻Synechocystissp.PCC6803的hoxEFUYH氫酶基因，并在產(chǎn)氣腸桿菌中表達(dá)，結(jié)果表明：藍(lán)藻HoxEFUYH蛋白的異源表達(dá)提高了細(xì)菌的產(chǎn)氫能力，最大產(chǎn)氫速率和累積產(chǎn)氫量均比原菌有較大幅度提高，其中，表達(dá)F和U亞基的重組菌株E.aerogenes/HoxFU的產(chǎn)氫量最高，從未重組前的1.14molH2/mol葡萄糖提高達(dá)到2.29molH2/mol葡萄糖，最