羧酸酯酶E4、細(xì)胞色素P450CYP9G2和羧酸酯酶B1突變基因的重組酶對農(nóng)藥的生物降解.pdf

1、本研究從抗有機(jī)磷殺蟲劑的桃蚜Myzuspersicae成蟲細(xì)胞的勻漿中提取總RNA，用RT-PCR方法擴(kuò)增出羧酸酯酶E4(CbEE4)的編碼基因，序列分析結(jié)果表明該基因開放閱讀框由1659個核苷酸組成，推測產(chǎn)生的編碼產(chǎn)物由552個氨基酸組成，N端23個氨基酸為信號肽，同時克隆了不含信號肽的CbEE4編碼基因。桃蚜CbEE4基因與庫蚊Culexpipiens羧酸酯酶B1基因核苷酸序列的同源性為54％，翻譯后的蛋白質(zhì)的氨基酸序列同源性為35

2、％。將CbEE4基因亞克隆到表達(dá)載體pET28b，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，體外誘導(dǎo)表達(dá)，含信號肽的E4基因不能在大腸桿菌中表達(dá)，無信號肽的E4基因能高效表達(dá)產(chǎn)生融合蛋白，該蛋白能迅速降解羧酸酯酶特異性底物a-乙酸萘酯和β-乙酸萘酯。本研究發(fā)現(xiàn)重組CbEE4對擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯兩類農(nóng)藥有選擇性降解，并有著良好的水解活性。胺菊酯、聯(lián)苯菊酯、芐氯菊酯、西維因、仲丁威、克百威和殘殺威有良好的降解效果，其中，在2.5hr內(nèi)

3、能夠降解64％的西維因，在1.5hr內(nèi)能夠降解66％的胺菊酯，在3hr內(nèi)能夠降解69％和71％的聯(lián)苯菊酯和芐氯菊酯，在2.5hr內(nèi)能夠降解80％的馬拉硫磷。但是羧酸酯酶E4對其它的農(nóng)藥(如抗芽威和溴氰菊酯)并沒有檢測到降解效果，說明CbEE4對農(nóng)藥的水解與底物的結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系。對CbEE4的作用機(jī)理的研究，為從分子水平設(shè)計(jì)高效解毒酶提供理論依據(jù)。 細(xì)胞色素P450氧化還原酶(簡稱P450)是昆蟲體內(nèi)的一種多功能氧化酶，它不僅參與

4、激素、脂肪酸和甾醇類激素等內(nèi)源化合物的代謝，而且在藥物、殺蟲劑、植物毒素等外源物的解毒中也起著重要作用。在進(jìn)行酶解反應(yīng)時，需要NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶(簡稱P450還原酶，POR)作為輔酶。因此，本研究設(shè)計(jì)了在同一宿主菌中同時表達(dá)P450酶和P450還原酶，以得到具有P450生物活性的完整的酶系統(tǒng)。將來源于小菜蛾的CYP9G2基因和來源于家蠅的POR基因亞克隆到雙基因表達(dá)載體pETDuet，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(D

5、E3)，誘導(dǎo)表達(dá)得到的酶液做細(xì)胞色素P450和P450還原酶。本研究為探索細(xì)胞色素P450CYP9G2在農(nóng)藥殘留降解中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)得到的酶液做細(xì)胞色素P450和P450還原酶以13種有機(jī)磷農(nóng)藥和6種氨基甲酸酯農(nóng)藥為底物，進(jìn)行了降解實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)殺螟硫磷，樂果，甲基對硫磷，對硫磷，毒死蜱，馬拉硫磷，三唑磷，抗蚜威，滅多威和克百威在兩個小時內(nèi)有明顯降解效果，分別可以降解64％的殺螟硫磷、53％的樂果、62％的甲基

6、對硫磷、17％的對硫磷、29％的毒死蜱、19％的馬拉硫磷和26％的三唑磷。 通過體外定點(diǎn)突變，成功獲得蚊蟲羧酸酯酶B1的G110D、W224L和W224S三個單點(diǎn)突變體和G110D-W224L、G110D-W224S兩個雙點(diǎn)突變體，用pET28a載體在大腸桿菌BL21(DE3)高效表達(dá)、純化后，得到5個突變蛋白。測定B1及其突變體對4種有機(jī)磷殺蟲劑久效磷、毒蟲畏、馬拉硫磷、甲基1605的降解，它們分別是二甲氧基、二乙氧基氧化型和