魚鱗鈣離子結(jié)合活性肽的分離純化及其生理活性研究.pdf

1、迄今為止，我國水產(chǎn)加工業(yè)的快速發(fā)展所產(chǎn)生的大量下腳料尚未得到有效利用。本文以羅非魚魚鱗為原料，采用可控酶解技術(shù)制備鈣離子結(jié)合活性肽，經(jīng)分離純化和氨基酸序列鑒定，探討肽結(jié)構(gòu)與鈣離子結(jié)合活性的關(guān)系，并通過研究肽-鈣復(fù)合物對(duì)大鼠鈣吸收和骨質(zhì)量的影響，探析魚鱗肽-鈣復(fù)合物在體內(nèi)利用的有效性和安全性，主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　1.魚鱗鈣離子結(jié)合活性肽的酶解條件優(yōu)化
　　以鈣離子結(jié)合活性和水解度為指標(biāo)，研究胃蛋白酶、胰蛋白酶和風(fēng)味蛋

2、白酶的單酶和分步酶解方式對(duì)魚鱗的水解效果。結(jié)果顯示三種酶分步酶解時(shí)，魚鱗肽的鈣離子結(jié)合活性最高（1.04mmol/g），其水解度為22.24％。在分步酶解方式下，最優(yōu)的加酶順序是胃蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶。最適酶添加量和酶解時(shí)間分別為：胃蛋白酶，2.0%，4.5h；胰蛋白酶，2.5%，4.0h；風(fēng)味蛋白酶，1.0%，4.5h。此時(shí)魚鱗蛋白水解度達(dá)28.28%，比優(yōu)化前提高27.15%，鈣離子結(jié)合活性為1.33mmol/g，提高27.

3、88%。通過液相色譜測(cè)定酶解液分子量分布，證實(shí)酶解物主要為低分子量肽，主要組分分子量低于3kDa。
　　2.魚鱗鈣離子結(jié)合活性肽的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定
　　取魚鱗酶解液進(jìn)行分離純化，羥基磷灰石層析后，F(xiàn)3組分鈣離子結(jié)合活性最高（2.60 mmol/g），與未純化的魚鱗肽相比，活性增大95.18%，采用凝膠層析對(duì)其進(jìn)一步分離，F(xiàn)31活性較高（2.84 mmol/g），將其進(jìn)行RP-HPLC分析，得到3個(gè)主峰，收集F312（2.9

4、1 mmol/g）組分進(jìn)行MALDI-TOF-MS/MS分析，經(jīng)鑒定，其氨基酸序列為Asp-Gly-Asp-Asp-Gly-Glu-Ala-Gly-Lys-Ile-Gly（1033 Da）。采用紅外光譜分析儀對(duì)魚鱗鈣離子結(jié)合活性肽（FSP）及魚鱗肽-鈣復(fù)合物（FSP-Ca）進(jìn)行分析，結(jié)果顯示FSP-Ca紅外光譜圖中的特征峰出現(xiàn)了不同程度的偏移、增強(qiáng)及消失，推測(cè)多肽中的氨基和羧基是結(jié)合鈣離子的主要位點(diǎn)。
　　3.魚鱗肽與鈣離子結(jié)合條

5、件的優(yōu)化
　　以鈣離子結(jié)合率為指標(biāo)，對(duì)魚鱗肽與鈣離子結(jié)合的條件進(jìn)行了單因素優(yōu)化，結(jié)果表明溫度50℃、pH6.0、肽與鈣鹽質(zhì)量比6：1、時(shí)間30min，魚鱗肽的鈣離子結(jié)合率最高；將酶解液超濾，得到3個(gè)組分（<1kDa、1-5kDa、>5kDa），測(cè)定其鈣離子結(jié)合率，經(jīng)軟件擬合得到半數(shù)結(jié)合濃度（BC50），結(jié)果顯示，1-5kDa組分BC50最低（0.83mg/mL），>5kDa組分的BC50顯著高于其余兩組（P<0.05），這說明較低

6、分子量（<5kDa）的肽更利于與鈣結(jié)合。
　　4.魚鱗肽-鈣復(fù)合物的生理活性研究
　　通過飼喂低鈣飼料對(duì)大鼠進(jìn)行造模，并補(bǔ)充不同形式的鈣鹽，探討其對(duì)低鈣大鼠補(bǔ)鈣及相關(guān)生理功能的影響。結(jié)果表明，低鈣大鼠補(bǔ)充FSP-Ca和酪蛋白磷酸肽-鈣復(fù)合物（CPP-Ca）后，大鼠體重分別增加了25.53%和25.04%，顯著高于低鈣組（P<0.05）；代謝實(shí)驗(yàn)和血液指標(biāo)結(jié)果顯示，F(xiàn)SP-Ca組的鈣吸收率（64.18%）和血鈣含量（2.58m