基于特定位點(diǎn)廣泛突變的聚合酶體外表型分析.pdf

1、核苷（酸）類(lèi)似物應(yīng)用于慢性乙肝治療時(shí)常發(fā)生耐藥。聚合酶特定位點(diǎn)突變與耐藥有直接關(guān)系。在核苷類(lèi)似物耐藥相關(guān)研究中，對(duì)突變熱點(diǎn)進(jìn)行廣泛突變表型分析有助于理解基因型與表型的相互關(guān)系?，F(xiàn)有基于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的廣泛突變分析方法存在一些不足。本文中，我們建立了一種聚合酶特定位點(diǎn)廣泛突變表型分析的新策略，該方法結(jié)合了簡(jiǎn)并引物隨機(jī)突變方法以及聚合酶反式互補(bǔ)策略。以拉米夫定（lamivudine，LAM）耐藥位點(diǎn)rt204為例，我們檢驗(yàn)了該策略的可行性與實(shí)用性

2、。
　　目的：
　　通過(guò)結(jié)合簡(jiǎn)并引物隨機(jī)突變方法以及聚合酶反式互補(bǔ)策略，構(gòu)建一種聚合酶特定位點(diǎn)廣泛突變表型分析的新策略。
　　方法：
　　1.通過(guò)簡(jiǎn)并引物隨機(jī)突變和片斷替換反應(yīng)（Fragment Substitution Reaction,FSR），構(gòu)建RT區(qū)位點(diǎn)特異性的多種突變;
　　2.通過(guò)慢病毒包裝混合質(zhì)粒，將含特定位點(diǎn)多種突變引入293HBV-pol-穩(wěn)定細(xì)胞系；通過(guò)反式互補(bǔ)，拯救293HBV-po

3、l-中HBV復(fù)制，篩選獲得穩(wěn)定復(fù)制的單克隆細(xì)胞系進(jìn)行體外耐藥表型分析；
　　3.以rt204（LAM耐藥位點(diǎn)）為例，構(gòu)建包含rt204位點(diǎn)的隨機(jī)突變，經(jīng)慢病毒包裝后感染293HBV-pol-穩(wěn)定細(xì)胞系，經(jīng)抗性篩選及基因組DNA測(cè)序獲得包含特定突變的單克隆細(xì)胞系，進(jìn)行體外藥物敏感性分析。
　　結(jié)果：
　　簡(jiǎn)并引物隨機(jī)突變可有效地獲得含RT區(qū)特定位點(diǎn)的多種突變形式，我們通過(guò)隨機(jī)引物Rpol204引入了rt204位點(diǎn)兩個(gè)堿基

4、的隨機(jī)突變（NNT），F(xiàn)SR替換質(zhì)粒pLentipol-D相應(yīng)區(qū)段，構(gòu)建了慢病毒載體HBV重組表達(dá)質(zhì)粒（野生型和突變型），經(jīng)過(guò)一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得了rt204位點(diǎn)的野生型及14種突變型;經(jīng)抗性篩選及基因組測(cè)序獲得了6種單克隆細(xì)胞系用于耐藥檢測(cè)；
　　與野生型相比，突變型有明顯復(fù)制缺陷，rtM204I相對(duì)于野生型復(fù)制水平為3.039%，rt204N,RT204K與rt204I復(fù)制水平接近;部分突變類(lèi)型復(fù)制能力顯著降低，如rt204

5、T,rt204R,分別為0.102%，0.005%；經(jīng)LAM處理后，野生型復(fù)制水平下降了7倍左右（6.842±0.983），rt204I/T復(fù)制水平降低1倍左右（1.201±0.031，1.174±0.146），rt204N對(duì)LAM敏感性較高，經(jīng)藥物處理后，復(fù)制能力降低了近10倍，rt204K/R對(duì)LAM中度敏感。
　　結(jié)論：
　　我們成功建立了一種新的突變表型分析方法，其特點(diǎn)有：1.通過(guò)一輪PCR及FSR，獲得特定位點(diǎn)廣泛

6、突變；2.通過(guò)一次慢病毒包裝，獲得含多種突變形式的慢病毒池；3.通過(guò)反式互補(bǔ)的方式獲得含聚合酶突變的穩(wěn)定細(xì)胞系用于藥物敏感性分析。該策略較傳統(tǒng)方法而言，具有簡(jiǎn)便，高效，變異率低等特點(diǎn)。利用該策略，我們成功構(gòu)建了rt204位點(diǎn)的多種突變形式，證實(shí)了各突變型較野生型有明顯功能缺陷。在使用LAM處理的情況下，rt204I/T占競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。這一結(jié)果符合既往文獻(xiàn)報(bào)道，且能合理解釋臨床相關(guān)耐藥現(xiàn)象。以上結(jié)果提示該方法具有可行性。我們建立的這一實(shí)驗(yàn)策略