骨保護素緩釋系統(tǒng)的制備及體外實驗.pdf

1、背景與目的:
　　骨量不足一直是制約口腔種植適用性和成功率的重要因素。隨著破骨細胞骨吸收機制相關研究的不斷深入，抑制破骨細胞分化形成的骨代謝平衡調控可能為骨量不足問題的解決提供了一種可行方案。目前研究顯示，骨保護素/核因子-κB受體活化因子配體/核因子-κB受體活化因子（OPG/RANKL/RANK）信號轉導通路在破骨細胞的激活過程中發(fā)揮關鍵作用，OPG可以與 RANKL競爭性結合，阻斷其與破骨細胞前體、成熟破骨細胞表面的RANK

2、受體結合，從而抑制破骨細胞的分化形成并加快其凋亡。OPG在預防口腔正畸效果反彈、治療絕經(jīng)后骨質疏松、體外RAW264.7細胞系誘導培養(yǎng)等方面的研究也確認了其抑制破骨細胞分化形成、減少骨量丟失的作用。由于OPG全身給藥可能引發(fā)心血管、骨硬化癥等系統(tǒng)并發(fā)癥，局部直接用藥又容易藥物流失，目前有學者提出OPG局部緩釋給藥的用藥途徑以提高其利用率，降低用藥風險。PLGA作為最常用的生物降解型材料，以其為載體構建的藥物緩釋給藥系統(tǒng)具有良好的生物相容

3、性。本課題擬通過PLGA包裹rhOPG構建微球緩釋系統(tǒng)，對比分析傳統(tǒng)和改良球/液分離方法所得緩釋微球在形態(tài)結構、載釋藥特性方面的差異；通過體外破骨細胞誘導培養(yǎng)，驗證 rhOPG/PLGA微球緩釋系統(tǒng)的生物安全性、生物有效性，為下一步的動物實驗提供支持。
　　方法:
　　1、復乳溶劑揮發(fā)法配合球/液傳統(tǒng)分離法和改良分離法制備空白PLGA微球和 rhOPG-PLGA微球，并通過激光粒徑分析儀、光學和電子顯微鏡、rhOPG-ELI

4、SA檢測對比分析微球粒徑、形態(tài)、載藥率、包封率以及釋藥特性。
　　2、處死4周齡SD大鼠，分離、提純脛、股骨全骨髓細胞，隨機設置空白PLGA組、rhOPG/PLGA組和對照組進行實驗因素處理，倒置顯微鏡下觀察及HE染色、TRAP染色分析細胞生長狀態(tài)、細胞類型和數(shù)量，SPSS21.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。
　　結果:
　　1、傳統(tǒng)分離組：空白 PLGA微球粒徑(152±13)um，rhOPG-PLGA微球粒徑(151±

5、21)um，微球形態(tài)不規(guī)整，有粘連，空白PLGA微球鏡下見中央透光或折光圓形亮區(qū)；rhOPG載藥率5.25*10-7，包封率62.49*10-2，1d突釋率為27.25*10-2，28d累計釋藥89.91*10-2。
　　2、改良分離組：空白 PLGA微球粒徑(142±19)um，rhOPG-PLGA微球粒徑(157±16)um，形態(tài)圓整，無粘連，微球表面微孔均勻；rhOPG載藥率7.69*10-7，包封率51.72*10-2，1

6、d突釋率為37.96*10-2，28d累計釋藥98.27*10-2。
　　3、細胞培養(yǎng)：空白PLGA組和對照組可見TRAP陽性的破骨細胞或破骨樣細胞，胞漿紅染、有大小不等的空泡，胞膜邊緣不規(guī)則、有偽足樣突起。rhOPG-PLGA組觀察到相對較多單核細胞生成，TRAP陽性細胞較少或者無。
　　4、TRAP陽性細胞計數(shù)：空白PLGA組和對照組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；rhOPG-PLGA組與其余兩組差異有統(tǒng)計學意義（P＜