納升級多維液相色譜法研究蛋白質(zhì)組.pdf

1、蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法，主要依賴于分離技術(shù)和檢測技術(shù)的突破性進(jìn)展。2D-PAGE是目前最通用的蛋白質(zhì)組的分離方法。但是2D-PAGE仍存在一些難以克服的缺陷，尋找2D-PAGE的替代技術(shù)是目前生物技術(shù)領(lǐng)域研究的一個熱點(diǎn)。發(fā)展兩維乃至多維色譜分離方法，可從根本上解決這個問題。 本研究以研究多維色譜分離方法為主要方向，搭建了一個納升級的二維液相色譜分離平臺，并將此用于人肝癌蛋白質(zhì)組的分離與鑒定中，經(jīng)過條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)該平臺具有很好的分離

2、能力，可以完全實(shí)現(xiàn)自動化，是一個無歧視性的蛋白質(zhì)組分析平臺。用此平臺，鑒定出人肝癌蛋白質(zhì)組中的229種蛋白，其中一些與肝癌的發(fā)病機(jī)理有關(guān)。同時發(fā)現(xiàn)在整個蛋白質(zhì)鑒定中，多肽在LC中預(yù)測的保留數(shù)據(jù)可以輔助串級質(zhì)譜鑒定出更多的蛋白，提高了鑒定的數(shù)量和鑒定的可靠性。并進(jìn)一步對此LC保留模型進(jìn)行了改進(jìn)，使它更適合于預(yù)測大的肽段的保留，獲得了滿意的結(jié)果。 本研究共分三大部分，主要內(nèi)容如下；1.肝癌(Hepatocellularcarcino

3、maHCC)是全世界發(fā)病率最高的五大癌癥之一。為了了解肝癌發(fā)現(xiàn)的機(jī)理，蛋白質(zhì)組學(xué)提供了一個強(qiáng)有力的分析手段。搭建一個自動的納升級全二維分離體系(nano2D-LC-ESI-MS/MS)用于分析HCC蛋白質(zhì)組，其中強(qiáng)陽離子交換(SCX)為第一維，毛細(xì)管反相液相色譜(cRPLC)為第二維。使用這個系統(tǒng)，復(fù)雜樣品的上樣，除鹽，分離和分析可以達(dá)到完全的自動化。經(jīng)過分別對兩維的條件優(yōu)化，這個蛋白質(zhì)組分析程序可以用于分離和鑒定大分子量的蛋白(＞10

4、0000)，小分子量的蛋白(＜20000)，強(qiáng)堿性的蛋白(pl＞9.5)和疏水性的蛋白，而這些蛋白在二維凝膠電泳上都不能得到很好的分離。最后運(yùn)用這個系統(tǒng)鑒定了人肝癌細(xì)胞中229種蛋白。在它們中間，一些蛋白被發(fā)現(xiàn)與肝癌的發(fā)生和病變有關(guān)。并在此基礎(chǔ)上，發(fā)展SEC-SCX-RPLC三維色譜分離模式。 2.二維液相色譜在線的偶聯(lián)電噴霧串級質(zhì)譜是蛋白質(zhì)分離與鑒定的一個新平臺。一般多肽首先由2D-LC進(jìn)行分離，然后用ESI-MS/MS進(jìn)行分

5、析，最后用串級質(zhì)譜產(chǎn)生的數(shù)據(jù)度對其進(jìn)行鑒定。在一次2D-LC-ESI-MS/MS分析中不僅能夠直接從質(zhì)譜中得到多肽荷質(zhì)比的信息(m/z)，而且也能夠同時得到多肽在LC上的保留時間，而多肽的保留時間一直未能與串級質(zhì)譜相聯(lián)用來鑒定蛋白。在本研究中，發(fā)現(xiàn)用組成肽段的每個氨基酸的疏水性貢獻(xiàn)對多肽在RPLC上的保留進(jìn)行預(yù)測，從而可以使多肽的色譜信息輔助串級質(zhì)譜鑒定蛋白。這樣，蛋白可由四種類型的信息來鑒定，一是肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)，序列信息，M

6、S/MS離子得分，預(yù)測的保留時間。這個附加的信息可輔助串級質(zhì)譜鑒定蛋白，鑒定率提高了16％，而且不需要花費(fèi)額外的費(fèi)用。 3.小肽的保留可以通過組成多肽的每個氨基酸的疏水性貢獻(xiàn)的加和來預(yù)測。但當(dāng)多肽的長度大于10-15殘基時，多肽的保留時間要小于氨基酸殘基的保留系數(shù)相加得到的預(yù)測結(jié)果。在本章中，考慮多肽的長度和每個氨基酸殘基與固定相的接觸面積，提出了一個新的預(yù)測模型。對這個模型用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)運(yùn)用新模型可以提高預(yù)