光合細(xì)菌生物不對(duì)稱(chēng)加氫催化體系的研究.pdf

1、利用生物轉(zhuǎn)化制備具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的高光學(xué)純度手性化合物是當(dāng)前生物技術(shù)中一個(gè)具有理論意義和應(yīng)用價(jià)值的領(lǐng)域，關(guān)于在生物不對(duì)稱(chēng)加氫過(guò)程中利用光能進(jìn)行不放氧光合作用推動(dòng)輔酶(NADPH)再生的光合細(xì)菌作為催化細(xì)胞的研究國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本論文以能進(jìn)行不放氧光合作用的類(lèi)球紅桿菌(Rhodobacter sphaeroides)作為生物催化劑，采用苯乙酮還原轉(zhuǎn)化具有光學(xué)活性的苯乙醇的反應(yīng)為模型反應(yīng)，前期實(shí)驗(yàn)證明在最優(yōu)反應(yīng)條件下的發(fā)酵培養(yǎng)基中其產(chǎn)物

2、的收率在90％以上，產(chǎn)物的光學(xué)純度更是高達(dá)99％。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討了光合細(xì)菌生物不對(duì)稱(chēng)加氫催化體系的催化機(jī)理及其底物適用范圍;催化體系產(chǎn)物的收率、光學(xué)構(gòu)型、ee值的調(diào)控因素;另外為了減少底物對(duì)催化細(xì)胞的毒害作用，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)光合生物的固定化及其在化學(xué)反應(yīng)器中的原位再生，以期實(shí)現(xiàn)高光學(xué)純度的手性中間體的工業(yè)化生產(chǎn)，我們還研究了水/有機(jī)相催化體系。得出如下結(jié)論:
　　1、對(duì)光合細(xì)菌生物不對(duì)稱(chēng)加氫催化體系的催化條件進(jìn)行了研究，選擇了同

3、類(lèi)研究中應(yīng)用最廣的苯乙酮作為反應(yīng)的模型底物，通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)和相關(guān)文獻(xiàn)查閱，選定對(duì)光合細(xì)菌生物不對(duì)稱(chēng)加氫催化體系影響最大的三個(gè)因素:pH值、底物濃度和催化細(xì)胞的菌體濃度作為單因子，考查了它們對(duì)催化體系的產(chǎn)物收率和ee值的影響，并在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面方法(Response Surface Methodology，RSM)優(yōu)化催化條件參數(shù)，確定了催化體系的最佳pH值為6.97，最佳底物濃度:17.58 mmol/L，最佳菌體細(xì)胞濃度:215 g

4、/L，為工業(yè)化生產(chǎn)制備重要手性中間體奠定理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。
　　2、根據(jù)該催化體系的特點(diǎn)，建立了以氣相色譜(GC)、火焰離子檢測(cè)器(FID)作為手段的檢測(cè)方法。采用標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較和添加產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照的方法進(jìn)行定性和定量分析。
　　3、通過(guò)制備類(lèi)球紅桿菌(Rhodobacter sphaeroides)的載色體和分離純化的胞內(nèi)氧化還原酶混合液，構(gòu)建了以類(lèi)球紅桿菌全細(xì)胞、S-氧化還原酶和R-氧化還原酶混合液以及載色體與氧化還原酶

5、耦合為生物催化劑的三種不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)體系，并向反應(yīng)體系中加入能提高產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的最適氫供體乙酸鈉和電子供體硫代硫酸鈉。通過(guò)檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物的收率、對(duì)映體過(guò)量(ee)值和光學(xué)構(gòu)型，分析了光合細(xì)菌生物不對(duì)稱(chēng)加氫的生物催化機(jī)理，光照條件下，位于細(xì)胞膜載色體上的捕光色素將吸收的光量子傳遞到光化學(xué)反應(yīng)中心的菌綠素分子Bch1上，Bch1吸收一個(gè)光量子后由基態(tài)轉(zhuǎn)變成激發(fā)態(tài)Bch1*，Bch1*分子釋放的高能電子經(jīng)過(guò)非循環(huán)式光電子傳遞鏈傳遞，還原NADP+

6、為不對(duì)稱(chēng)加氫過(guò)程中所必需的輔酶NADPH，通過(guò)加入供氫體和供電子體的方式補(bǔ)充N(xiāo)ADPH再生所需的活性H和菌綠素分子Bch1失去的電子，這就是上述反應(yīng)中在載色體或全細(xì)胞存在時(shí)，加入乙酸鈉和硫代硫酸鈉后，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率和ee值大幅提高的原因。光照使得細(xì)胞內(nèi)S-氧化還原酶的活性遠(yuǎn)高于R-氧化還原酶，此時(shí)胞內(nèi)再生的輔酶NADPH同等條件下只能被S-氧化還原酶緊密結(jié)合和利用，而R-氧化還原酶由于活性相對(duì)較低，沒(méi)有足夠的輔酶可利用。因此光照條件下的e

7、e值遠(yuǎn)高于黑暗條件下，并且其產(chǎn)物以S-苯乙醇為主。而黑暗條件下S-氧化還原酶未被激活，無(wú)法大量結(jié)合輔酶NADPH，胞內(nèi)S-氧化還原酶和R-氧化還原酶活性差異不大，結(jié)合NADPH的能力也相似，因此反應(yīng)的ee值較低，產(chǎn)物以R-苯乙醇為主，同時(shí)由于沒(méi)有輔酶NADPH再生所必需的光能的提供，反應(yīng)的產(chǎn)率也較低。
　　4、通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)反應(yīng)過(guò)程中加入氫供體和電子供體后可以提高產(chǎn)物收率，在闡明生物催化機(jī)理的基礎(chǔ)上分析硫代硫酸鈉和乙酸鈉分別為最佳電

8、子供體和最佳氫供體的原因。同時(shí)考查了光照和反應(yīng)前對(duì)菌體細(xì)胞進(jìn)行熱預(yù)處理后產(chǎn)物的光學(xué)構(gòu)型和產(chǎn)物收率的變化。試驗(yàn)結(jié)果表明光照條件下產(chǎn)物是生成S-苯乙醇，黑暗條件下則是生成R-苯乙醇，當(dāng)熱預(yù)處理溫度高于51℃，產(chǎn)物以R-苯乙醇為主，其中在54℃時(shí)產(chǎn)物R-苯乙醇的ee值達(dá)到最高的93.6％，溫度在51℃以下產(chǎn)物則是以S-苯乙醇為主，其中30℃時(shí)產(chǎn)物的ee值為最高的94.0％。
　　5、比較石油醚、環(huán)己烷、正庚烷、正己烷、正辛烷在兩相體系中

9、對(duì)催化細(xì)胞的生物相容性和對(duì)底物、產(chǎn)物的分配性能，確定出兩相體系中的最佳有機(jī)溶劑。用該有機(jī)溶劑處理類(lèi)球紅桿菌(Rhodobacter sphaeroides)菌體細(xì)胞后，通過(guò)分光光度計(jì)(Ultrospec3300 pro，Amersham Biosciences)對(duì)其胞內(nèi)氧化還原酶的酶活進(jìn)行測(cè)定，研究了菌體細(xì)胞對(duì)最佳有機(jī)溶劑的耐受性。其次比較了在水溶液體系和兩相體系中類(lèi)球紅桿菌(Rhodobacter sphaeroides)細(xì)胞催化苯乙

10、酮的不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)過(guò)程。最后，為了優(yōu)化反應(yīng)工藝，分別考察了相體積比、振蕩速度、生物量/底物量之比、反應(yīng)溫度以及反應(yīng)體系的pH值對(duì)還原反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)水相與有機(jī)溶劑相體積比、振蕩速度、反應(yīng)時(shí)間、pH這些因素對(duì)反應(yīng)的ee值影響較小，但是對(duì)反應(yīng)的產(chǎn)物收率卻有著較大影響。水相pH在7.0有利于反應(yīng)的進(jìn)行;振蕩速度180 r/min;水與有機(jī)溶劑之比在1∶1為最佳;反應(yīng)時(shí)間控制在48 h可達(dá)到反應(yīng)的最大產(chǎn)物收率。
　　6、通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以知道光