Cys突變對于GcGAST蛋白抗氧化活性的影響.pdf

1、赤霉酸誘導(dǎo)的富含半胱氨酸蛋白是一類在植物多種生理過程當(dāng)中都發(fā)揮著重要作用的蛋白。2006、2010年 Eigoda等人報(bào)道該蛋白家族成員在體內(nèi)具有抗氧化活性,但其詳細(xì)的抗氧化機(jī)理尚不清楚。由于這些蛋白C-末端含有12個(gè)保守的半胱氨酸殘基,而Cys除了穩(wěn)定結(jié)構(gòu)外,還可能具有抗氧化活性,因此本論文擬探討這些Cys殘基對于GcGAST蛋白抗氧化功能的影響并研究其包涵體的二級結(jié)構(gòu)。
　　方法:在重組質(zhì)粒構(gòu)建方面,選擇pET-28(a)作為

2、原核表達(dá)載體。在此基礎(chǔ)上,采用PCR定點(diǎn)突變技術(shù),將重組質(zhì)粒作為模板進(jìn)行突變。這樣我們可以得到十二個(gè)半胱氨酸單突變體。選擇大腸桿菌BL21(DE3)作為原核表達(dá)載體,采用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,分別選擇全細(xì)胞及包涵體,檢測它們清除H2O2的能力。此外,還運(yùn)用FTIR手段、吸收光譜研究GcGASA包涵體的二級結(jié)構(gòu)及致密程度等。
　　結(jié)果:將突變體外送測序發(fā)現(xiàn),該載體中已經(jīng)成功插入了目標(biāo)基因gcgasa。與此同時(shí),12個(gè)半胱氨酸

3、突變位點(diǎn)也被成功引入載體中。SDS-PAGE結(jié)果表明,包涵體在誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白中大量存在。大腸桿菌工程菌抗氧化活性實(shí)驗(yàn)表明,表達(dá)野生型GcGASA蛋白的大腸桿菌能夠耐受一定濃度的H2O2,但突變后突變體的抗氧化活性有所降低。包涵體抗氧化活性實(shí)驗(yàn)顯示,對于野生型蛋白,它具有清除 H2O2能力,且隨著蛋白濃度的提高,清除能力增強(qiáng);對于突變體,即便是在較高濃度下,清除H2O2能力也不強(qiáng)。此外,我們通過比較DTT處理的結(jié)果發(fā)現(xiàn)對于野生型GcGAS