花生蛋白肽的檢測(cè)及抗氧化活性研究.pdf

1、花生，作為一種油料經(jīng)濟(jì)作物，在世界范圍內(nèi)受到廣泛的栽種，擁有巨大的生產(chǎn)和消費(fèi)需求。花生含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，脂肪占50％，蛋白質(zhì)占24％-36％，礦物質(zhì)占3％、以及少量的維生素、植物固醇等。目前僅有27％的花生被用來食用，遠(yuǎn)低于國(guó)外40％的食用率。數(shù)據(jù)顯示，花生的初級(jí)加工產(chǎn)品的出口額占其出口總額的92.7％，而精深加工產(chǎn)品僅占了7.3％。實(shí)際上，精深加工產(chǎn)品可增值2-10倍，而初級(jí)加工產(chǎn)品僅可增值0.5-1.0倍，因而為了提高花生的經(jīng)濟(jì)效

2、益，需不斷進(jìn)行精深加工研究?；ㄉ膶儆诨ㄉ鞍椎木罴庸ぎa(chǎn)品，經(jīng)分解得到，屬于小分子的氨基酸聚合物，是一種功能性物質(zhì)。
　　 本文主要研究氨基酸分析儀測(cè)定法、雙縮脲法、凱氏定氮法和紫外分光光度法在花生肽含量測(cè)定中的應(yīng)用，并通過對(duì)純化花生肽的分析，了解其特性，制備抗氧化性花生肽。
　　 (1)蛋白質(zhì)沉淀劑的篩選及應(yīng)用條件
　　 八種試劑三氯乙酸、草酸、磺基水楊酸、硫酸、鹽酸、磷酸、乙醇和丙酮的沉淀效果經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，采

3、用雙縮脲方法時(shí)，三氯乙酸為最佳沉淀劑;采用凱氏定氮法測(cè)定時(shí)，三氯乙酸、草酸、磷酸和乙醇可作為沉淀劑。三氯乙酸為最佳沉淀劑，兩種方法皆可選用。
　　 用最佳沉淀劑三氯乙酸沉淀樣品中的蛋白質(zhì)，其濃度可在0.66-1.32mol/L范圍內(nèi)選擇。當(dāng)0.66mol/L三氯乙酸與樣品1∶1混勻反應(yīng)，40min內(nèi)，離心過濾，4h內(nèi)完成測(cè)定。當(dāng)1.32mol/L三氯乙酸與樣品1∶1混勻反應(yīng)，沉淀30min后離心過濾，2h內(nèi)完成測(cè)定。清液可在低溫

4、下進(jìn)行短期的保藏。
　　 (2)酸溶花生肽含量的測(cè)定
　　 經(jīng)氨基酸分析儀測(cè)定酸溶花生肽的游離氨基酸和水解氨基酸的含量，算得酸溶花生肽的含量為0.49g/100g。
　　 雙縮脲法的測(cè)定條件:保持清液溫度與環(huán)境溫度一致;TCA濃度為1.32mol/L時(shí)，至少需反應(yīng)20min;低于該濃度，至少需反應(yīng)30min;保持反應(yīng)體系pH穩(wěn)定，清液與雙縮脲試劑的最佳體積比為1∶3。雙縮脲法測(cè)得酸溶花生肽的含量為0.69g/10

5、0g。與氨基酸分析儀測(cè)定的含量值相比，該法的測(cè)定結(jié)果偏大。
　　 根據(jù)酸溶花生肽轉(zhuǎn)化系數(shù)的五種計(jì)算方式，算得KA、KA’、KP、K、K’值，分別為4.90、4.70、3.55、4.22、4.13，相應(yīng)的酸溶花生肽含量分別為0.57g/100g、0.54g/100g、0.38g/100g、0.47g/100g、0.46g/100g。比較發(fā)現(xiàn)，K值計(jì)算得到的肽含量值0.47g/100g最接近氨基酸分析儀測(cè)得的含量值0.49g/100

6、g。故花生肽的轉(zhuǎn)化系數(shù)為4.22，遠(yuǎn)低于花生蛋白的轉(zhuǎn)化系數(shù)5.46。
　　 (3)花生肽的純化工藝
　　 按原產(chǎn)品工藝制備花生蛋白酶解物，將其進(jìn)行脫脂和大孔樹脂純化實(shí)驗(yàn)。脫脂工藝:每5.00g花生肽60℃干燥3h，加入30.00mL正己烷，在70℃下，脫脂6h。大孔樹脂純化工藝:用DA201-C型大孔樹脂填充柱子，將50.00mL30.00mg/mL的脫脂花生蛋白酶解物以0.5mL/min的速度上樣，并用75％的乙醇以2

7、.0mL/min的速度洗脫柱子，收集278nm波長(zhǎng)下的純化副產(chǎn)品PP1，和250nm紫外波長(zhǎng)下的花生肽PP2。
　　 (4)純化花生肽含量的測(cè)定
　　 10.00mg/mLPP1和PP2，經(jīng)紫外分光光度法和熒光探針法測(cè)定，兩者的含量值與疏水值分別為（9.47±0.086mg/mL，1328.70）、(28.13±0.13mg/mL，8146.00)。由此表明，疏水性大的，紫外測(cè)定結(jié)果偏大。
　　 雙縮脲法測(cè)定時(shí)發(fā)

8、現(xiàn)，10.00mg/mLPP1和PP2含量分別為1.40±0.065mg/mL、0.68±0.052mg/mL。測(cè)定結(jié)果遠(yuǎn)小于紫外測(cè)定結(jié)果。
　　 (5)純化花生肽的抗氧化分析
　　 PP1和PP2清除羥基自由基的能力分別為4.32％和35.97％。將PP2用SephadexG-25凝膠過濾，根據(jù)凝膠過濾的原理，按出峰順序可知，組分分子量的大小為:組分1＞組分2＞組分3，而各組分清除羥基自由基的能力強(qiáng)弱為:組分2(42.

9、09％)＞組分1(32.01％)＞組分3(19.42％)，故肽的分子量越小并不意味著清除羥基自由基的能力越強(qiáng)。
　　 調(diào)節(jié)PP2溶液pH值，比較各pH下沉淀出的肽清除羥基自由基的能力，發(fā)現(xiàn)pI3肽清除能力最強(qiáng)。
　　 (6)含有抗氧化花生肽水解液的制備工藝
　　 以抗氧化花生肽（pI為3）清除羥基自由基的能力作為指標(biāo)，對(duì)加酶量、酶解時(shí)間、酶解pH和酶解溫度的正交實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行選擇，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最佳實(shí)驗(yàn)條件為: