粗糙脈孢菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建研究.pdf

1、絲狀真菌因其擁有強(qiáng)大的蛋白分泌能力而被廣泛應(yīng)用于工業(yè)酶的生產(chǎn)。隨著基因工程與分子生物學(xué)的發(fā)展，利用絲狀真菌生產(chǎn)重組蛋白越來越受到人們的關(guān)注。由于任何單一菌種都不能滿足不同工業(yè)蛋白質(zhì)生產(chǎn)的需求，因此更多的絲狀真菌加入到蛋白質(zhì)表達(dá)宿主菌的候選名單。粗糙脈孢菌具有良好的蛋白表達(dá)和分泌能力，并且擁有良好的遺傳學(xué)研究基礎(chǔ)和基因組數(shù)據(jù)，是利用分子生物學(xué)改造構(gòu)建纖維素酶生產(chǎn)菌株和生產(chǎn)其他目的蛋白的理想菌種，所以利用粗糙脈孢菌構(gòu)建蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)，在基因工

2、程操作上具有明顯優(yōu)勢。目前已經(jīng)有開發(fā)粗糙脈孢菌作為蛋白質(zhì)表達(dá)體系的研究，包括表達(dá)生產(chǎn)植物蛋白、疫苗抗體和內(nèi)切葡聚糖酶等，這些研究表明粗糙脈孢菌是發(fā)展新型異源蛋白表達(dá)的良好體系，具有較大的潛力。
　　本研究利用粗糙脈孢菌良好的基因組研究資源和全基因組基因敲除突變體庫，從載體和宿主改造兩方面開展研究，初步建立了纖維二糖誘導(dǎo)的粗糙脈孢菌蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。木研究以3個(gè)β-葡萄糖苷酶缺失的三突變株(3ΔβG)為出發(fā)菌株，通過真菌雜交技術(shù)進(jìn)一步

3、缺失了兩個(gè)纖維二糖水解酶CBH1和CBH2，構(gòu)建了組氨酸缺陷型六突變?nèi)笔Ь闘Q-1（Δ3βG∷Δ2cbh∷Δhis3），該菌株可以利用纖維二糖作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)纖維素酶啟動(dòng)子表達(dá)，同時(shí)又消除了纖維二糖水解酶蛋白的背景條帶，可以作為蛋白表達(dá)的宿主菌株。同時(shí)，構(gòu)建了分別含有粗糙脈孢菌自身強(qiáng)肩動(dòng)子（Pcbh-1、Pcbh-2和Ptef-1）的3個(gè)新的表達(dá)載體，該載體帶有融合標(biāo)簽蛋白tev-6xhis-gfp，能夠高效方便的篩選陽性轉(zhuǎn)化子，也有利