簡介：生物化學與分子生物學實驗室簡介生物化學與分子生物學實驗室簡介生物化學（BIOCHEMISTRY）是研究生物體的化學組成和生命過程中化學變化規(guī)律的科學。它主要采用化學以及物理學和免疫學等原理和方法，從分子水平來探討生命現(xiàn)象的本質(zhì)，故又稱生命的化學。通常將核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能及其表達調(diào)控等的研究，稱為分子生物學（MOLECULARBIOLOGY）。生物化學既是重要的醫(yī)學基礎(chǔ)學科，又與其它學科有著廣泛的聯(lián)系與交叉。一、概況長沙醫(yī)學院生物化學與分子生物學實驗室成立于2008年6月，隸屬長沙醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學系，生化實驗室總面積為1979平方米，布局合理，學生實驗直接用房面積為1300平方米，每次學生實驗人均使用面積為108平方米。學科現(xiàn)有教師21人，其中高級職稱3人（教授1人、副教授2人）。學歷結(jié)構(gòu)合理，博士2人，碩士研究生11人。學科負責人朱傳炳教授。學科設有生物化學實驗室、分子生物學實驗室、生物化學與分子生物學科學研究室、儀器室、生化實驗技術(shù)研究室等，具備供教師和學生使用的多種儀器設備。二、教學生物化學與分子生物學是長沙醫(yī)學院主干學科之一。生物化學和分子生物學實驗室常年承擔臨床、護理、藥學、預防、口腔、針推、中醫(yī)、影像專業(yè)的生物化學、分子生物學等實驗課課程，年平均完成3557學時實驗教學任務。在實驗教學中我們不斷更新教學內(nèi)容，規(guī)范教學各環(huán)節(jié)，注重教師的教學質(zhì)量，加強實驗室的建設，培養(yǎng)學生的實踐操作能力，使學生的生物化學學習質(zhì)量一直處于優(yōu)秀水平。2007、2008、2009連續(xù)三年獲長沙醫(yī)學院先進集體，2010年獲得“三育人”先進集體。還有多名教師獲得長沙醫(yī)學院教學優(yōu)秀獎。三、科研實驗室輔助教研室教師從事再生障礙性貧血能量代謝障礙的研究、血吸蟲疫苗研究、心臟發(fā)育相關(guān)基因的蛋白質(zhì)組學研究、腫瘤的單基因功能研究、動脈粥樣硬化、原發(fā)性膝骨性關(guān)節(jié)炎的基因多態(tài)性、天然產(chǎn)物的提取純化及其作用等七個方向的研究，目前共承擔湖南省科技廳、教育廳等科研項目十余項，科研經(jīng)費二十余萬，發(fā)表論文三十余篇，主編參編學術(shù)著作、教材6部。獲湖南醫(yī)學科技獎二等獎一項。

簡介：1生物化學與分子生物學專業(yè)碩博連讀研究生培養(yǎng)方案一、培養(yǎng)目的本專業(yè)培養(yǎng)德、智、體全面發(fā)展的生物化學與分子生物學高級專門人才，要求學生堅持四項基本原則，熱愛祖國，具有良好的道德品質(zhì)，具有團結(jié)合作，勇于追求真理和獻身于科學研究及教育的精神。掌握本學科堅實寬厚的基礎(chǔ)理論和系統(tǒng)深入的專門知識，熟悉學科的發(fā)展趨勢，并需掌握一定的相關(guān)學科的知識。熟練地掌握科學研究的基本技能和方法，具有獨立從事科學研究工作的能力，在有關(guān)領(lǐng)域中做出創(chuàng)造性的成果。能熟練地運用至少一門外國語。二、研究方向基因表達與調(diào)控；基因的結(jié)構(gòu)、功能與進化；醫(yī)藥生化及分子生物學；分子生物學含基因工程；分子進化；癌變的分子機理；生物信息學；功能基因組學及其相關(guān)技術(shù)；RNA基因與調(diào)控；分子免疫學；腫瘤治療的分子基礎(chǔ)；微生物分子遺傳學；微生物分子生態(tài)；海洋分子生物學；植物分子生物學；藥物發(fā)現(xiàn)及分子生物學；蛋白質(zhì)組學與免疫學；魚類分子免疫學；免疫細胞信號傳導。三、學習年限按中山大學學位與研究生教育工作手冊及中大研院20033號中山大學碩博連讀研究生培養(yǎng)工作試行辦法的規(guī)定要求。碩士學制三年。四、課程設置類別編號課程名稱開課學期學時學分任課教師職稱考核方式0000002101第一外國語FIRSTFEIGNLANGUAGE11205外語學院考試公共課0000002103馬克思主義理論THEYOFMARXISM1，2724教育學院考試0710211102基因組學與生物信息學GENOMICSBIOINFMATICS2804徐安龍教授等考試基礎(chǔ)課0710102102生化與分子生物學研究技術(shù)METHODSINBIOCHEMISTRYMOLECULARBIOLOGY3804屈良鵠教授考試3300002101生命科學進展ADVANCEINLIFESCIENCES12804徐安龍教授等考試必修課專業(yè)課0710102104生化與分子生物學專題TOPICSOFBIOCHEMISTRYMOLECULARBIOLOGY23804各導師考試30710102212分子生物學文獻LITERATURESINMOLECULARBIOLOGY1603張尚宏副教授考試0710091208公共數(shù)據(jù)庫及文獻檢索與論文寫作PUBLICDATABASEAPPLICATION，LITERATURESEARCHPAPERWRITING13603莊詩美教授鄭利民教授考試0710102214生物分子進化概論PRINCIPLEOFMOLECULAREVOLUTION1402蘇應娟副教授考試0710102215物種形成的分子機制MOLECULARMECHANISMOFSPECIATION2603蘇應娟副教授考試0710102216分子系統(tǒng)與進化MOLECULARSYSTEMATICSEVOLUTION2603陳月琴教授屈良鵠教授考試0710102217進化基因組學EVOLUTIONARYGENOMICS2603張尚宏副教授考試0710211204生化制藥原理與應用PRINCIPLEOFBIOCHEMPHARMACEUTICALSITSAPPLICATION2603任政華副教授考試0710102219生物技術(shù)與藥物開發(fā)BIOTECHNOLOGYDRUGDISCOVERY2603吳文言副教授考試0710102220中藥DNA指紋圖譜鑒定的原理與方法PRINCIPLEMETHODOFDNAFINGERPRINTINGIDENTIFICATIONINCHINESEMEDICINE1402蘇應娟副教授考試選修課專業(yè)選修課0710102221海洋生物資源與環(huán)境的分子生物學方法METHODSOFMOLECULARBIOLOGYINOCEANBIESOURCEENVIRONMENT2603陳月琴教授考試

簡介：分子生物學實驗教學大綱一、課程基本信息課程編碼091118B課程名稱分子生物學實驗英文名稱EXPERIMENTOFMOLECULARBIOLOGY課程類別專業(yè)必修課總學時24總學分1適用專業(yè)生物科學二、實驗課程的性質(zhì)、目標與任務1分子生物學已成為生命科學的基礎(chǔ)學科之一，其基本理論和實驗技術(shù)已滲透到生物學的各個領(lǐng)域并促進了一批新學科的興起和發(fā)展。目前，以分子生物學為基礎(chǔ)的基因克隆重組技術(shù)已成為現(xiàn)代生物技術(shù)的核心。因此，在掌握基本分子生物學理論的基礎(chǔ)上，為培養(yǎng)學生在分子生物學技術(shù)方面的實際動手能力，開設本實驗課程。2目標通過實驗原理的講解和實驗操作，使學生初步了解和熟悉現(xiàn)代分子生物學實驗的基本原理、操作技能和實際應用，提高學生的創(chuàng)新思維和獨立分析問題、解決問題的能力。3通過本課程的實驗教學和實驗操作，要求學生熟練掌握下列分子生物學實驗技術(shù)大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒DNA的分離及純化，瓊脂糖凝膠電泳，PCR擴增，DNA重組、轉(zhuǎn)化與檢測實驗等。三、實驗課程教學基本要求（1）注重分子生物學基礎(chǔ)實驗技能的掌握與提高，提升學生的動手操作能力；（2）實驗課前要預習，明確每次實驗的目的、原理與基本步驟；（3）實驗過程中要具有嚴謹科學的態(tài)度，尊重事實與實驗結(jié)果，要善于發(fā)現(xiàn)問題、分析問題、解決問題；（4）樹立學生之間的交流與合作意識。四、實驗教學內(nèi)容及要求實驗一大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備5涂平板6菌落培養(yǎng)【所需主要儀器設備】1超凈工作臺2恒溫水浴3恒溫搖床實驗三質(zhì)粒DNA的提取【實驗類型】基礎(chǔ)性實驗【目的與要求】堿裂解法提取質(zhì)粒的技術(shù)和方法。注意加入三種溶液的先后順序，在提取過程中，動作要輕柔?！緝?nèi)容提要】堿裂解法提取質(zhì)粒利用的是環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線狀的染色體DNA片段在拓撲學上的差異來分離它們。在PH值介于120125這個狹窄的范圍內(nèi)，線狀的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開變性，在這樣的條件下，共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵雖然斷裂，但兩條互補鏈彼此依然相互盤繞而緊密地結(jié)合在一起。當加入PH48的醋酸鉀高鹽緩沖液使PH降低至中性后，共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補鏈迅速而準確地復性，而線狀的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，不能迅速而準確地復性，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)SDS復合物等一起沉淀下來，而質(zhì)粒DNA卻留在上清液中。實驗操作步驟1收集菌體2加入三種溶液3離心4質(zhì)粒的純化5質(zhì)粒的保存【所需主要儀器設備】1恒溫培養(yǎng)箱2恒溫搖床3小型高速離心機4漩渦混合器實驗四瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA【實驗類型】

簡介：分子生物學部分開發(fā)實驗,植物遺傳親緣關(guān)系研究,實驗目的,運用PCRRAPD分子標記技術(shù)，對不同種植物的基因組DNA進行PCR擴增，獲得指紋圖譜。同時運用統(tǒng)計分析方法，計算不同物種的遺傳距離，得出物種間的親緣關(guān)系。,實驗材料,植物樣品花椰菜1，花椰菜2，花椰菜3,實驗試劑及儀器,10BUFFER500MMKCL100MMTRISHCLPH9001明膠1TRITONX100MGCL225MM４DNTP1MM引物3種RAPD引物50UM模板20NG/ΜLTAQ酶5U/ΜLPCR儀，凝膠成像系統(tǒng)，電泳系統(tǒng),實驗方法,１．向無菌的500ΜLEPPENDORF管中依次加入以下溶液。反應物體積10BUFFER25ΜL4DNTP1MM25ΜLMGCL225MM25ΜL無菌水105ΜLTAQ酶1U/UL1ΜL引物2ΜL模板DNA20NG4ΜL總體積25ΜL,,2．反應體系混勻，離心3．在ＰＣＲ儀上按以下方式循環(huán)94℃變性１分鐘36℃退火１分鐘72℃延伸２分鐘經(jīng)過40個循環(huán)4．７２℃延伸反應7分鐘。5．取20ΜL反應液加4ΜLLOADINGBUFFER在615％瓊脂糖凝膠上120伏，電泳2小時。7在凝膠成像系統(tǒng)上觀察記錄實驗結(jié),根據(jù)RAPD擴增結(jié)果計算1遺傳相似性系數(shù)SS2NXY/NXNYNXY為種間共有的擴增帶，NX為X種具有的擴增帶，NY為Y種具有的擴增帶2遺傳距離（D）D1－S,結(jié)果分析,

簡介：APOPTOSIS細胞凋亡研究方法建立與評價,蔣紀愷,研究生,研究方向研究立題（研究背景、發(fā)現(xiàn)問題、提出問題（）、提出假設、解決問題的策略與方法）申請課題，獲得經(jīng)費實驗驗證（實驗模型、技術(shù)指標、方法建立與評價）結(jié)果分析（撰寫論文，申報專利，評獎）,,研究方向白血病研究立題腫瘤靶向治療的分子機制研究。文獻閱讀與學習。信號轉(zhuǎn)導在白血病發(fā)生與治療的背景知識研究模型白血病細胞株；動物模型等技術(shù)平臺實驗技術(shù)的建立與評價，（技術(shù)指標，動手能力）結(jié)果分析統(tǒng)計學知識，文獻回顧論文撰寫語言能力,研究背景,腫瘤治療手術(shù)放療化療骨髓移植（白血?。?增殖分化凋亡SURVIVALGROWTHDIFFERETIATIONAPOPTOSIS腫瘤TUMOUR,,,,,,立題依據(jù),增殖細胞通過分裂使細胞數(shù)目增加的過程，細胞分裂。（真核細胞的增殖方式有有絲分裂、減數(shù)分裂、無絲分裂三種方式，只有連續(xù)進行有絲分裂的細胞才具有細胞周期。）分化在個體發(fā)育中，通過細胞分裂后產(chǎn)生的子代細胞比上一代細胞具有更專一的功能。后代在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生穩(wěn)定性的差異過程稱為細胞分化（CELLULARDIFFERENTIATION）。（比如血液中的紅細胞、白細胞、淋巴細胞、血小板等都是從造血干細胞分化出來的，但是與造血干細胞相比，這些子代細胞都具有更加專一的功能。）凋亡細胞凋亡指的細胞的程序性死亡，細胞被自身的酶降解，按一定的步驟“自殺”，其死亡細胞仍為一整體，最終被白細胞吞噬。（而細胞壞死會有細胞壁破裂的現(xiàn)象，內(nèi)含物外泄，會影響周圍的細胞。）,,,,啟動凋亡早期凋亡中期凋亡晚期,CASPASE激活,★核染色質(zhì)凝縮★細胞膜PS外翻★線粒體膜電位喪失★DNA被切割成片段,凋亡小體形成,信號通路,,研究模型,慢性粒細胞白血?。–HRONICMYELOGENOUSLEUKEMIA，CML）逆轉(zhuǎn)K562CELLLINE分化（紅系細胞）增殖凋亡藥物誘導,,,,,LEUKEMIACELLLINES,K562CELLSABCRABLPOSITIVEERYTHROLEUKAMIALINEDERIVEDFROMA53YEAROLDFEMALECMLPATIENTINBLASTCRISISPHILADELPHIACHROMOSOME,,LEUKEMIACELLLINES,HL60HUMANPROMYELOCYTICLEUKEMIACELLSDERIVEDFROMA36YEAROLDWOMANWITHACUTEPROMYELOCYTICLEUKEMIAATTHENATIONALCANCERINSTITUTE,,研究方法建立與評價,靈敏度特異性蛋白質(zhì)分析1，染色2，酶3，免疫分泌蛋白、膜蛋白、細胞質(zhì)，細胞核蛋白,方法學建立與研究策略,藥物濃度的選擇（MTT）形態(tài)學觀察（凋亡小體形成）DNA被切割成片段細胞膜PS外翻CASPASE激活信號通路,MTT測定細胞增殖,MTT法（四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法）是MOSMANN1983年報告的。原理是活細胞內(nèi)線粒體脫氫酶能將四氮唑化物（MTT）由黃色還原為紫紅（蘭）色的甲（肷）紫,后者溶于有機溶劑（如二甲基亞楓、酸化異丙醇等）,甲紫（肷）產(chǎn)量與細胞活性成正比?？稍?60NM處用酶標儀測定其OD值。,形態(tài)學觀察,DNA被切割成片段,ANNEXINV,基本原理細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面，目前早期識別仍有困難。這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞膜外，使PS暴露在細胞膜外表面。PS是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內(nèi)面，在細胞發(fā)生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。ANNEXINV是一種CA依賴的磷脂結(jié)合蛋白，最初發(fā)現(xiàn)是一種具有很強的抗凝血特性的血管蛋白，ANNEXINV具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性。對PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS。PS轉(zhuǎn)移到細胞膜外不是凋亡所獨特的，也可發(fā)生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。因此，可以建立一種用ANNEXINV結(jié)合在細胞膜表面作為凋亡的指示并結(jié)合一種染料排除試驗以檢測細胞膜的完整性的檢測方法。,細胞膜PS外翻,GOSSYPOL（24H）,,,個體化靶向治療,DEFICIENCY,,CHINESEHERBALMEDICINEINCHAOSHANAREA,

簡介：分子生物學基本技術(shù),講授內(nèi)容,一、分子雜交與印記技術(shù)二、PCR技術(shù)三、基因文庫四、DNA測序技術(shù)五、芯片技術(shù)六、蛋白質(zhì)相互作用研究,一、分子雜交與印跡技術(shù)MOLECULARHYBRIDIZATIONBLOTTINGTECHNOLOGY,核酸分子雜交NUCLEICACIDHYBRIDIZATION在DNA復性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈HETERODUPLEX。,一、基本原理,（一）印跡技術(shù)（二）探針技術(shù),探針PROBE一小段用同位素、生物素或熒光染料標標記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。,二、印跡技術(shù)的類別及應用,（一）DNA印跡技術(shù)SOUTHERNBLOTTING用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。,（二）RNA印跡技術(shù)NORTHERNBLOTTING用于RNA的定性定量分析。,（三）蛋白質(zhì)的印跡分析WESTERNBLOTTING用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。,三種印跡技術(shù)的比較,放射自顯影照片,其他雜交技術(shù)斑點印跡DOTBLOTTING原位雜交INSITUHYBRIDIZATIONDNA點陣DNAARRAYDNA芯片技術(shù)DNACHIP,斑點雜交（DOTBLOTTING）,將RNA或DNA變性后直接點樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，用于基因組中特定基因及其表達產(chǎn)物的定性及定量的研究。,反向斑點雜交（REVERSEDOTBLOTTING）,先將探針固定于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，將樣品RNA或DNA標記變性后進行雜交。改變了傳統(tǒng)雜交方法中一次雜交只能檢測一種樣品的局限，大大提高了基因診斷的效率。,13,原位分子雜交技術(shù),原位雜交（INSITUHYBRIDIZATION，ISH）即利用分子雜交技術(shù)來進行基因及其表達產(chǎn)物定位分析的一種技術(shù)；可用于基因及其表達產(chǎn)物的定位分析。,熒光原位雜交（FISH）,DNA點陣,二、聚合酶鏈反應POLYMERASECHAINREACTION,,5?,PRIMER1,,5?,PRIMER2,,,,5?,5?,TEMPLATEDNA,,,,,,一、基本原理,,,,,,,,,模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶DNTPSMG2,二、PCR體系基本組成成分,三、PCR的基本反應步驟,變性95?C,延伸72?C,退火TM5?C,,,,,（一）目的基因的克隆（二）基因的體外突變（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列測定（五）基因突變分析,四、PCR的主要用途,三、幾種重要的PCR衍生技術(shù),（一）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（二）原位PCR技術(shù)（三）實時PCR技術(shù),實時PCR技術(shù)原理,三、基因文庫GENELIBRARY,基因組DNA文庫GENOMICDNALIBRARYCDNA文庫CDNALIBRARY,基因文庫GENELIBRARY,是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。,基因組DNA文庫,第一輪篩選,第二輪篩選,第三輪篩選,基因組文庫篩選結(jié)果舉例,四、DNA序列測定分析NUCLEICACIDSEQUENCEANALYSIS,一、DNA鏈末端合成終止法,二、DNA自動測序,采用熒光替代放射性核素標記是實現(xiàn)DNA序列分析自動化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標記四種雙脫氧核苷酸，然后進行SANGER測序反應，反應產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細管電泳）分離后，通過四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。,DNA自動測序結(jié)果舉例,五、芯片分析技術(shù),BIOLOGICALCHIPTECHNOLOGY,DNA芯片DNACHIPCDNA芯片CDNACHIP是指將許多特定的DNA片段或CDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上。,一、基因芯片,基因芯片GENECHIP,是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當與待測蛋白樣品反應時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性和定量分析的一種技術(shù)。,二、蛋白質(zhì)芯片,蛋白質(zhì)芯片PROTEINCHIP,

簡介：COMPARATIVEGENOMICSANDTHEEVOLUTIONOFPROKARYOTES,崔仕超（10708040）,主要內(nèi)容,基因組學分子進化的新紀元原核生物基因組基因譜系的進化HGT和基因系統(tǒng)的進化系統(tǒng)發(fā)育和HGT所面臨的問題結(jié)語和展望,基因組學分子進化的新紀元,原核生物的在進化研究中的優(yōu)勢基因組學為微觀進化和宏觀進化中所研究的遺傳物質(zhì)提供了非常豐富的信息利用比較基因組學的方法將這些信息進行整合總結(jié),原核生物基因組,原核生物基因復制和進化前導鏈和滯后鏈起始位點和終止位點（圖）原核生物基因組的多樣性開放宏基因組封閉宏基因組HGT（水平基因轉(zhuǎn)移）（圖）,基因譜系的進化,基因譜系多樣性基因的獲得和缺矢假基因移碼和置換（圖）新基因的進化HGT對基因譜系中突變的貢獻1520％ORF（開放閱讀框）富集HGT變形菌門和硬壁菌門的ORF與噬菌體中的序列有更高的同源性,HGT和基因系統(tǒng)的進化,TEICHMANN和MADANBABU的進化模型在調(diào)控的基因中有的45％的進化是由于復制和相互作用的遺傳所導致的當前觀點原核生物的基因通過HGT將周圍的功能基因的加入來進行進化，而周圍的功能則直接和與其相互作用的周圍的環(huán)境有關(guān)。功能基因?qū)毎麅?nèi)復雜的系統(tǒng)的適應TFS比基因又相對低的保守性,系統(tǒng)發(fā)育和HGT的問題,基因進化樹物種進化樹基因進化樹與物種進化樹的不一致HGT,結(jié)論和展望,組織形成,THANKYOU,,,,開放閱讀框如果一個閱讀框在起始密碼子后有50個以上的連續(xù)密碼子無終止密碼子，那么稱這段順序為開放閱讀框。長的開放閱讀框是為某個蛋白編碼的基因。一個相對分子質(zhì)量為60000的蛋白質(zhì)編碼不間斷的基因需要有一個含有500或更多的密碼子的開放閱讀框,,基因樹與物種樹的區(qū)別,當一個分子系統(tǒng)樹是根據(jù)某一基因數(shù)據(jù)構(gòu)建而來時，就稱為基因樹。物種樹則是指代表了一組物種進化過程的系統(tǒng)樹（NEI1987）?；驑渑c物種樹可能存在兩方面的區(qū)別。①對于某一被研究的基因，可能存在種內(nèi)的多態(tài)性。換言之，在物種分化之前，該基因可能已開始分化。因此，兩物種間該基因的分化時間可能早于這兩個物種的分化時間。由這一基因計算而來的分枝長度（分枝時間）可能偏高。對于較長時間的進化過程而言，因種內(nèi)多態(tài)性導致的這種誤差可以忽略不計。但是，對于新分化的物種，這種誤差的影響可能很大。②基因樹的分枝情況（拓撲結(jié)構(gòu)）可能不同于物種樹的。這種情況一般發(fā)生在分枝點非常接近的物種間。人、猩猩和大猩猩間的關(guān)系可能是較為典型的例子。這是因為DNA突變是隨機過程，在有限的序列內(nèi)可能存在著統(tǒng)計學上的偏差。通過增加DNA序列的長度并測定多個相互獨立的基因片段，一般可以避免這種問題的發(fā)生。,無乳鏈球菌STREPTOCOCCUSAGALACTIAEHALOQUADRATUMWALSBYI噬鹽古細菌芽孢桿菌目BACILLALESLACTOBACILLALE乳桿菌BACILLUSANTHRACIS（炭疽桿菌）XENOLOG異同源物由某一個水平基因轉(zhuǎn)移事件而得到的同源序列EXCISION切除刪除,

簡介：,作者朱月春張巧,,單位昆明醫(yī)科大學,第二十章,維生素,VITAMINS,,,,維生素概述,第一節(jié)脂溶性維生素,第二節(jié)水溶性維生素,,小結(jié),重點難點,維生素的定義、分類、名稱、活性形式及缺乏癥,維生素的生理功能及其作用機制,維生素的來源及每日攝取量,（一）定義,維生素VITAMIN是人體內(nèi)不能合成，或合成量甚少、不能滿足機體的需要，必須由食物供給，以維持正常生命活動的一類低分子量有機化合物，是人體的重要營養(yǎng)素之一。,,維生素概述,（二）分類,脂溶性維生素（LIPIDSOLUBLEVITAMIN）水溶性維生素（WATERSOLUBLEVITAMIN）,按照溶解特性的不同，維生素可分為兩大類,VITAMINSOVERVIEW,脂溶性維生素,第一節(jié),LIPIDSOLUBLEVTAMIN,（一）共同特點,均為疏水性化合物，易溶于脂類和有機溶劑，常隨脂類物質(zhì)被吸收在血液中與脂蛋白或特異性結(jié)合蛋白結(jié)合而運輸，不易被排泄，在體內(nèi)主要儲存于肝，故不需每日供給不同種類脂溶性維生素執(zhí)行不同的生物化學與生理功能脂類吸收障礙和食物中長期缺乏此類維生素可引起相應的缺乏癥，攝入過多則可發(fā)生中毒,脂溶性維生素,（二）種類,維生素A、維生素D、維生素E和維生素K,1結(jié)構(gòu)特征與天然形式,（一）一般性質(zhì),2來源動物性食品肝、肉類、蛋黃、乳制品、魚肝油等植物維生素A原（如Β胡蘿卜素）,脂溶性維生素維生素A,一、維生素A（視黃醇、抗干眼病維生素）,3活性形式視黃醇、視黃醛和視黃酸,異戊二烯衍生物，為不飽和一元醇A1（視黃醇）、A2（3脫氫視黃醇）,維生素A的結(jié)構(gòu),1視黃醛參與視覺傳導,（二）生物學功能,脂溶性維生素維生素A,視循環(huán),2視黃酸調(diào)控基因表達和細胞生長與分化,脂溶性維生素維生素A,3維生素A和胡蘿卜素是有效的抗氧化劑,4維生素A及其衍生物可抑制腫瘤生長,關(guān)鍵物質(zhì)9順視黃酸全反式視黃酸或全反式維甲酸（ALLTRANSRETINOICACID，ATRA）作用途徑與細胞內(nèi)核受體結(jié)合，進而與DNA反應元件作用,（三）維生素A缺乏癥及中毒,脂溶性維生素維生素A,1缺乏癥,2建議攝入量,中國成人膳食維生素A的平均需要量（EAR）男性560ΜG/D，女性為480ΜG/D,3中毒癥狀,夜盲癥干眼病增加機體對感染性疾病的敏感性,頭痛、惡心、共濟失調(diào)等中樞神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)肝細胞損傷和高脂血癥長骨增厚、高鈣血癥、軟組織鈣化等鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)表現(xiàn)皮膚干燥、脫屑和脫發(fā)等表現(xiàn),EARESTIMATEDAVERAGEREQUIREMENT,（一）一般性質(zhì),2來源魚油、蛋黃、肝，紫外線照射下由人體皮膚的7脫氫膽固醇合成,脂溶性維生素維生素D,二、維生素D（膽鈣化醇、麥角鈣化醇、抗佝僂病維生素）,3活性形式1,25二羥維生素D3,1,25二羥維生素D3的結(jié)構(gòu),是類固醇（STEROID）的衍生物，為環(huán)戊烷多氫菲類化合物。D3或稱膽鈣化醇（CHOLECALCIFEROL）、D2或稱麥角鈣化醇（ERGOCALCIFEROL）,1結(jié)構(gòu)特征,維生素D3在體內(nèi)的轉(zhuǎn)變,脂溶性維生素維生素D,,11,25OH2D3調(diào)節(jié)鈣磷代謝,（二）生物學功能,脂溶性維生素維生素D,21,25OH2D3影響細胞分化,其與靶細胞內(nèi)特異的核受體結(jié)合，調(diào)節(jié)鈣結(jié)合蛋白等基因的表達其通過信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)使鈣通道開放，發(fā)揮對鈣磷代謝的快速調(diào)節(jié)作用其可促進小腸對鈣、磷的吸收，維持血鈣和血磷的正常水平，促進骨和牙的鈣化,其可調(diào)節(jié)皮膚、大腸、前列腺、乳腺、胰島Β細胞等細胞的分化其可促進胰島Β細胞合成與分泌胰島素，具有對抗1型和2型糖尿病的作用其對某些腫瘤細胞具有抑制增殖和促進分化的作用,（三）維生素D缺乏癥及中毒,脂溶性維生素維生素D,1缺乏癥,2建議攝入量,中國居民膳食維生素D的平均需要量（EAR）為8ΜG/D,3中毒癥狀,夜盲癥佝僂?。▋和┸浌遣『凸琴|(zhì)疏松癥（成人）,因皮膚儲存7脫氫膽固醇有限，多曬太陽不致維生素D中毒高鈣血癥、高鈣尿癥、高血壓以及軟組織鈣化等口渴，皮膚瘙癢，嘔吐、腹瀉、尿頻等,1結(jié)構(gòu)特征與種類,（一）一般性質(zhì),2來源植物油、油性種子和麥芽,脂溶性維生素維生素E,三、維生素E（生育酚）,苯駢二氫吡喃的衍生物生育酚（TOCOPHEROL）、生育三烯酚（TOCOTRIENOL）,3活性形式生育酚的各類衍生物,維生素E的結(jié)構(gòu),1維生素E是體內(nèi)最重要的脂溶性抗氧化劑,（二）生物學功能,脂溶性維生素維生素E,2維生素E具有調(diào)節(jié)基因表達的作用,3維生素E促進血紅素的合成,機制捕捉過氧化脂質(zhì)自由基,保護生物膜的結(jié)構(gòu)與功能。,機制促進Δ氨基Γ酮戊酸ALA合酶和ALA脫水酶的活性,調(diào)控生育酚攝取和降解相關(guān)基因的表達延緩衰老調(diào)控脂類攝取與動脈硬化相關(guān)基因的表達預防和治療冠心病調(diào)控細胞外基質(zhì)蛋白、細胞黏附與炎癥相關(guān)基因的表達抗炎、維持正常免疫功能調(diào)控細胞信號系統(tǒng)和細胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達抑制細胞增殖，抗腫瘤,（三）維生素E缺乏癥及中毒,脂溶性維生素維生素E,1缺乏癥,2建議攝入量,3中毒癥狀,一般不易缺乏；早產(chǎn)兒與新生兒、脂類吸收障礙與肝損傷時可引起缺乏癥溶血性貧血可治療先兆流產(chǎn)及習慣性流產(chǎn),成人膳食維生素E的適宜攝入量（AI）為14MGΑTE/D,人類尚未發(fā)現(xiàn)維生素E中毒癥成人可耐受的最高攝入量（TOLERABLEUPPERINTAKELEVEL，UL）是600MGΑTE/D,ΑTE（ΑTOCOPHEROLEQUIVALENT）Α生育酚當量；AIADEQUATEINTAKE,1結(jié)構(gòu)特征,（一）一般性質(zhì),2活性形式2甲基1,4萘醌,脂溶性維生素維生素K,四、維生素K（植物甲萘醌、葉綠醌、凝血維生素）,K1，又稱植物甲萘醌或葉綠醌K2，腸道細菌的產(chǎn)物K3，人工合成的水溶性甲萘醌，可口服及注射,3來源深綠色蔬菜（如甘藍、菠菜、萵苣等）、植物油、腸道細菌合成,2甲基1,4萘醌的衍生物,維生素K的結(jié)構(gòu),1維生素K是凝血因子活化所必需的輔酶,（二）生物學功能,脂溶性維生素維生素K,2維生素K對骨代謝具有重要作用,3維生素K對減少動脈鈣化也具有重要的作用,是Γ谷氨酰羧化酶的輔酶，參與凝血因子的活化,因為骨鈣蛋白（OSTEOCALCIN）和骨基質(zhì)Γ羧基谷氨酸蛋白均是維生素K依賴蛋白。,（三）維生素K缺乏癥,脂溶性維生素維生素K,1缺乏癥,2建議攝入量,中國成人膳食維生素K的適宜攝入量（AI）為80ΜG/D,成人不易缺乏，新生兒可能缺乏脂類吸收障礙（如胰腺、膽管疾?。┤狈Φ闹饕Y狀易出血,水溶性維生素,第二節(jié),WATERSOLUBLEVITAMIN,（一）共同特點,在體內(nèi)主要構(gòu)成酶的輔助因子，直接影響酶的活性依賴食物提供，體內(nèi)過剩的水溶性維生素可隨尿排出，很少蓄積一般無中毒，但供給不足時可導致缺乏癥。,水溶性維生素,（二）種類,B族維生素（B1、B2、PP、B6、B12、生物素、泛酸和葉酸）維生素C,1來源,（一）一般性質(zhì),水溶性維生素維生素B1,一、維生素B1（硫胺素）,主要存在于豆類和種子外皮（如米糠）、胚芽、酵母和瘦肉中,2活性形式焦磷酸硫胺素（THIAMINEPYROPHOSPHATE，TPP），占體內(nèi)硫胺素總量的80,焦磷酸硫胺素的結(jié)構(gòu),（二）生物學功能,水溶性維生素維生素B1,1維生素B1在體內(nèi)能量代謝中發(fā)揮重要的作用,Α酮酸氧化脫羧酶多酶復合體的輔酶中轉(zhuǎn)酮醇酶的輔酶,2維生素B1在神經(jīng)傳導中起一定作用,合成乙酰膽堿的乙酰輔酶A主要來自于丙酮酸的氧化脫羧反應可作為膽堿酯酶的抑制劑，參與乙酰膽堿的代謝調(diào)控,（三）缺乏癥,水溶性維生素維生素B1,1缺乏癥,2建議攝入量,中國成人男性膳食維生素B1的平均需要量（EAR）為12MG/D，成人女性為10MG/D,腳氣?。˙ERIBERI），神經(jīng)末梢炎,1來源,（一）一般性質(zhì),水溶性維生素維生素B2,二、維生素B2（核黃素）,奶與奶制品、肝、蛋類和肉類等,2活性形式,FMN和FAD的結(jié)構(gòu),黃素單核苷酸（FMN）黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）,（二）生物學功能,水溶性維生素維生素B2,2參與煙酸和維生素B6的代謝,1為氧化還原酶的輔基，起遞氫體的作用,FMN（FAD）的遞氫作用,脂酰COA脫氫酶、琥珀酸脫氫酶等,3FAD作為谷胱甘肽還原酶的輔酶，參與體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng),作為輔酶參與色氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)闊熕岷蚔ITB6轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿徇炼呷┑姆磻?4FAD與CYTP450結(jié)合，參與藥物代謝,（三）缺乏癥,水溶性維生素維生素B2,1缺乏癥,2建議攝入量,中國成人膳食維生素B2的平均需要量（EAR）男性為14MG/D，成人女性為12MG/D,口角炎、唇炎、陰囊炎、眼瞼炎等,1來源,（一）一般性質(zhì),水溶性維生素維生素PP,三、維生素PP（尼克酸、尼克酰胺、抗癩皮病維生素）,廣泛存在于自然界,2活性形式,維生素PP及其活性形式的結(jié)構(gòu),煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）,（二）生物學功能,水溶性維生素維生素PP,NAD和NADP是多種不需氧脫氫酶的輔酶，發(fā)揮遞氫體的作用。,糖酵解的3磷酸甘油醛脫氫酶、檸檬酸循環(huán)的蘋果酸脫氫等以NAD為輔酶磷酸戊糖途徑的G6PD以NADP為輔酶，其產(chǎn)物R5P是核糖生成的主要途徑,維生素PP的遞氫作用,（三）缺乏癥,水溶性維生素維生素PP,1缺乏癥,3中毒癥狀,2建議攝入量,中國成人男性膳食維生素PP的平均需要量（EAR）為12MGNE/D，成人女性為10MGNE/D,癩皮病（PELLAGRA）主要表現(xiàn)有皮炎、腹瀉及癡呆,NE（NIACINEQUIVALENT）煙酸當量,血管擴張、臉頰潮紅、痤瘡及胃腸不適等長期用量超過500MG/D,可致肝損傷,1來源,（一）一般性質(zhì),水溶性維生素泛酸,四、泛酸（遍多酸、維生素B5）,廣泛存在于動、植物組織中,2活性形式,輔酶A的結(jié)構(gòu),輔酶A（COA?；d體蛋白（ACYLCARRIERPROTEIN，ACP）,（二）生物學功能,水溶性維生素泛酸,COA及ACP構(gòu)成?；D(zhuǎn)移酶的輔酶，參與糖、脂類、蛋白質(zhì)代謝及肝的生物轉(zhuǎn)化作用,（三）缺乏癥,2建議攝入量,中國居民膳食泛酸的適宜攝入量（AI）是50MG/D,缺乏癥少見早期癥狀易疲勞、胃腸功能障礙等疾病嚴重缺乏最顯著特征是出現(xiàn)肢神經(jīng)痛綜合征,1缺乏癥狀,1來源,（一）一般性質(zhì),水溶性維生素生物素,五、生物素（維生素H、維生素B7、輔酶R）,肝、腎、酵母、蛋類、花生、牛乳、魚類、啤酒等，腸道細菌也可合成,2活性形式生物素,生物素的結(jié)構(gòu),（二）生物學功能,水溶性維生素生物素,1為羧化酶丙酮酸羧化酶、乙酰COA羧化酶等的輔基，參與CO2固定，為脂肪與糖代謝所必需,2通過生物素化，參與細胞信號轉(zhuǎn)導、基因表達調(diào)控、DNA損傷修復等,（三）缺乏癥,少見食用生雞蛋，可缺乏（生物素與抗生物素蛋白結(jié)合后不被吸收）長期使用抗生素可缺乏疲乏、惡心、皮炎及脫屑性紅皮病,2建議攝入量,中國居民膳食生物素的適宜攝入量（AI）是40ΜG/D,1缺乏癥狀,1來源,（一）一般性質(zhì),水溶性維生素維生素B6,六、維生素B6（吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺）,2活性形式磷酸吡哆醛、磷酸吡哆胺,維生素B6及其活性形式的結(jié)構(gòu)與互變,肉類、豆類、堅果、蛋黃、酵母等,（二）生物學功能,1磷酸吡哆醛是多種酶的輔酶,水溶性維生素維生素B6,參與氨基酸脫氨基、鳥氨酸循環(huán)、血紅素合成和糖原分解等，在代謝中發(fā)揮著重要作用,2磷酸吡哆醛可終止類固醇激素作用的發(fā)揮,機制將類固醇激素受體復合物從DNA中移去，終止激素的作用,（三）缺乏癥與中毒,低血色素小細胞性貧血（又稱維生素B6反應性貧血）和血清鐵增高。脂溢性皮炎，故VITB6又稱抗皮炎維生素攝入量超過200MG/D,可引起神經(jīng)損傷,中國居民膳食維生素B6的平均需要量（EAR）是12MG/D,1來源,（一）一般性質(zhì),水溶性維生素葉酸,七、葉酸（蝶酰谷氨酸）,2活性形式5,6,7,8四氫葉酸（FH4）,葉酸的結(jié)構(gòu),酵母、肝、水果、綠葉蔬菜，腸菌合成,N5、N10是一碳單位的結(jié)合位點,（二）生物學功能,1FH4是一碳單位轉(zhuǎn)移酶的輔酶。一碳單位參與嘌呤、胸腺嘧啶核苷酸等多種物質(zhì)的合成2甲氨蝶呤和氨蝶呤與葉酸機構(gòu)相似，抑制FH4合成，有抗腫瘤作用,水溶性維生素葉酸,（三）缺乏癥,中國居民膳食葉酸的平均需要量（EAR）是320ΜGDFE/D,巨幼紅細胞性貧血（MEGALOBLASTICANEMIA）高同型半胱氨酸血癥孕婦如果葉酸缺乏，可能造成胎兒脊柱裂和神經(jīng)管缺陷,DFF（DIETARYFOLATEEQUIVALENT）膳食葉酸當量,1來源,（一）一般性質(zhì),水溶性維生素維生素B12,八、維生素B12（鈷胺素、抗惡性貧血維生素）,2活性形式,由微生物合成，酵母和動物肝含量豐富,維生素B12的結(jié)構(gòu),甲鈷胺素5′脫氧腺苷鈷胺素,（二）生物學功能,1是N5CH3FH4轉(zhuǎn)甲基酶（甲硫氨酸合成酶）的輔酶，催化同型半胱氨酸甲基化生成甲硫氨酸2是L甲基丙二酰COA變位酶的輔酶，催化琥珀酰COA的生成,水溶性維生素維生素B12,（三）缺乏癥,中國居民膳食B12的平均需要量（EAR）是20ΜG/D,萎縮性胃炎、胃全切患者或內(nèi)因子先天性缺陷者，可因B12的吸收障礙而出現(xiàn)缺乏癥。巨幼紅細胞性貧血，B12也稱為抗惡性貧血維生素高同型半胱氨酸血癥髓鞘質(zhì)變性退化,1來源,（一）一般性質(zhì),水溶性維生素維生素C,九、維生素C（L抗壞血酸）,2活性形式L抗壞血酸,維生素C的結(jié)構(gòu)及遞氫作用,廣泛存在于新鮮蔬菜和水果中,（二）生物學功能,1參與體內(nèi)多種羥化反應2作為抗氧化劑直接參與體內(nèi)氧化還原反應3維生素C具有增強機體免疫力的作用,水溶性維生素維生素C,（三）缺乏癥與中毒,中國居民膳食維生素C的平均需要量（EAR）是85MG/D。,引起壞血?。⊿CURVY）影響膽固醇轉(zhuǎn)化，是動脈硬化的危險因素之一長期過量攝入，可能引發(fā)結(jié)石,維生素定義、分類、名稱及活性形式,脂溶性維生素（維生素A、D、E和K）的生理功能及缺乏癥狀,水溶性維生素（B族維生素（B1、B2、PP、B6、B12、生物素、泛酸和葉酸）和維生素C）的生理功能及缺乏癥狀,參考本章的網(wǎng)絡資源表（維生素分類、活性形式、生理功能、缺乏癥與需要量）,

簡介：分子生物學實驗原理,,,,第一節(jié)分子生物學發(fā)展概述,分子生物學MOLECULARBIOLOGY是在分子水平上研究生物的結(jié)構(gòu)、組織和功能的科學。1950年，ASTBURY在一次學術(shù)報告中，首次提出并使用了分子生物學這一名詞術(shù)語。廣義和狹義之分醫(yī)學分子生物學是應用分子生物學技術(shù)和理論來闡明人體正常生理活動和病理過程及其調(diào)控的分子機理。,分子生物學理論與實際應用的成就理論方面1關(guān)于腫瘤的發(fā)生提出了腫瘤起源于細胞增殖和分化調(diào)控的失常和細胞同它周圍組織關(guān)系的紊亂。癌基因100多種；抑癌基因20多種細胞周期調(diào)控系統(tǒng)細胞凋亡端粒酶,2關(guān)于艾滋病ACQUIREDIMMUNEDEFICIENCYSYNDROMEHIV序列；疫苗3關(guān)于慢性病CHRONICDISEASE，如心血管疾病、肥胖、糖尿病、骨質(zhì)疏松，發(fā)現(xiàn)了相關(guān)基因及其多態(tài)性。4關(guān)于生長、發(fā)育與進化的統(tǒng)一理論，也深入到了分子水平。,實際應用方面,,1轉(zhuǎn)基因植物目前已鑒定和克隆化的用于轉(zhuǎn)基因植物的基因有100多個?？钩輨⒖估ハx、抗病毒、抗不良環(huán)境因素（抗寒、抗鹽堿地、抗旱、抗?jié)常?、提高作物的產(chǎn)量、提高蛋白質(zhì)含量、改善氨基酸構(gòu)成等。,2轉(zhuǎn)基因動物1983年，超級小白鼠，體重是正常鼠的2倍。隨后出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因豬、羊、雞、兔、牛、鯉魚等。我國目前研究了金魚、鯉魚、圓頭魴。3基因工程多肽藥物與疫苗主要指DNA體外重組技術(shù)所研制的產(chǎn)品，轉(zhuǎn)基因動物和植物所研制的產(chǎn)品，以及蛋白質(zhì)工程技術(shù)所研制或改進的產(chǎn)品。,4基因診斷與基因治療基因診斷GENEDIAGNOSIS是指通過直接探查基因的存在狀態(tài)或缺陷，從而對疾病作出診斷的方法。目的物DNA或RNA方法核酸分子雜交技術(shù)、PCR技術(shù)、DNA芯片技術(shù)疾病遺傳性疾病；傳染病或感染性疾病,基因治療GENETHERAPY指將正常的外源基因?qū)肷矬w靶細胞內(nèi)，以彌補所缺失的基因，關(guān)閉或降低異常表達的基因，以達到治療疾病的目的。治療疾病遺傳病惡性腫瘤傳染病,5環(huán)境監(jiān)測與凈化AREASURVEYANDDEPOLLUTION監(jiān)測可檢測環(huán)境中的病毒和細菌凈化改造細菌分解環(huán)境中的石油、殘留的農(nóng)藥和有毒金屬6克隆動物CLONEANIMAL1997年“多利”克隆羊克隆器官（干細胞STEMCELL技術(shù)）,7人類基因組計劃HUMANGENOMEPROJECTHGP1990年，美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）和美國能源部聯(lián)合發(fā)表了人類基因組計劃。30億個堿基對，估計有3萬～4萬個人類基因。2000年6月26日，首次繪成人類基因組“工作框架圖”。2003年4月14日，中、美、日、德、法、英等6國科學家及領(lǐng)導人宣布人類基因組序列圖繪制成功，人類基因組計劃的所有目標全部實現(xiàn)。,意義與“阿波羅”登月計劃相媲美1996年諾貝爾化學獎得主羅伯特柯特認為，20世紀是物理學和化學的世紀，21世紀將是生物學的世紀。推動分子生物學更加快速地發(fā)展蛋白質(zhì)組學、代謝蛋白質(zhì)組學、藥物蛋白質(zhì)組學、毒物蛋白質(zhì)組學、營養(yǎng)蛋白質(zhì)組學及各種計劃,對其他相關(guān)學科的影響,,1向其他學科滲透2形成了許多新興的邊緣學科基礎(chǔ)醫(yī)學方面腫瘤分子生物學、免疫分子生物學、神經(jīng)分子生物學等預防醫(yī)學方面分子營養(yǎng)學、分子毒理學、分子流行病學、遺傳流行病學、人類基因組流行病學、公共衛(wèi)生遺傳學,,在預防醫(yī)學中的應用及發(fā)展方向,1慢性病的研究慢性病的發(fā)病原因絕大多數(shù)是基因與外界環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。2環(huán)境因素對人類遺傳物質(zhì)損傷的研究及“三致”毒性的研究生物標志物的研究和評價方法的建立3環(huán)境監(jiān)測與污染物的凈化。,4遺傳病的產(chǎn)前診斷（基因型預防）及早期診斷（表型預防）。5某些重要疾病的生物工程疫苗的研制。6對環(huán)境因素敏感基因及易感人群的研究環(huán)境基因組計劃（環(huán)境基因組學）（1）環(huán)境應答反應基因（2）篩選多態(tài)性及易感性（3）根據(jù)易感性制定不同的干預計劃,一、分子生物學一些重要的理論知識,1分子生物學發(fā)展史上一些重要的事件（1）1865年，“遺傳學之父”GMENDEL根據(jù)豌豆雜交試驗結(jié)果，創(chuàng)立了遺傳因子學說，即遺傳的分離律和自由組合律。（2）1903年WSUTTON提出染色體是MENDEL遺傳單位的載體的概念。（3）1909年，WJOHANNSEN將這種在染色體上的遺傳單位定名為基因（GENE）。,（4）1910年，現(xiàn)代實驗遺傳學奠基人THMORGAN和他的研究生在研究果蠅的遺傳規(guī)律時發(fā)現(xiàn)了基因的連鎖律和交換律。（5）1944年，OTAVERY等人（3人）分離出細菌DNA，并發(fā)現(xiàn)DNA是攜帶生命遺傳物質(zhì)的分子。（6）1950年，ASTBURY在一次演講中，首次使用了“分子生物學”術(shù)語。（7）1953年，WATSON和CRICK提出了DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型，揭示了遺傳物質(zhì)自我復制的機制。,（8）1961年至1966年，NIRENBERG和CRICK等人破譯了DNA遺傳密碼，1966年破譯了64個遺傳密碼。提出了遺傳信息由DNA→RNA→蛋白質(zhì)傳遞的中心法則。（9）1969年，JONATHANBECKWITH及其同事在哈佛大學成功分離出第一個基因。（10）1970年，發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶。（11）1961年，F(xiàn)JACOB和JMONOD提出了乳糖操縱子學說。,（12）自1946年起的20年當中，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了許多質(zhì)粒；1968年至1970年又發(fā)現(xiàn)了許多限制性內(nèi)切酶，為DNA體外重組提供了有利工具。（13）1973年，重組DNA技術(shù)問世。（14）1986年，KMULLIS等建立了PCR技術(shù)（15）1990年，人類基因組計劃。,2三個重要理論IMPORTANTTHEORY1DNA的結(jié)構(gòu)、復制、中心法則基本構(gòu)成單位是核苷酸核苷酸由脫氧核糖、堿基和磷酸構(gòu)成。堿基分別是腺嘌呤A、鳥嘌呤G、胸腺嘧啶T和胞嘧啶C。相鄰的兩個核苷酸以磷酸二酯鍵相連進一步盤旋、折疊，形成三級或四級結(jié)構(gòu),RNA與DNA有如下不同點五碳糖為核糖不是脫氧核糖；堿基中有尿嘧啶UURACIL而沒有胸腺嘧啶RNA為單鏈，不是雙鏈，但RNA單鏈之間相鄰的堿基可由氫鍵作用形成局部雙鏈。DNA存在于細胞核的染色體、線粒體以及染色體以外的質(zhì)粒中質(zhì)粒是一些雙鏈，閉環(huán)的DNA分子。,,DNA或RNA結(jié)構(gòu)給我們的啟示①DNA或RNA是水溶性的。這是由于含有磷酸基因、羥基和氨基。在核酸提取過程中，我們保留的是水相、而不是有機相。②核酸是兩性電離，既帶正電荷，又帶負電荷。它的等電點PI為2～25。在中性溶液中帶負電荷。對核酸進行電泳時，點樣時應點在負極；雜交時選擇尼龍膜時，最好選擇帶正電荷的尼龍膜。核酸帶負電荷，容易吸附到帶正電荷的膜上，牢固，不掉,③DNA在細胞中存在部位不同細胞核、線粒體、質(zhì)粒，所以應注意提取方法的不同④由于DNA空間構(gòu)象不同，在電泳時遷移率不同。⑤根據(jù)堿基互補配對原則，可設計引物和探針雜交。⑥由于DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和RNA易由于分子內(nèi)氫鏈作用形成二級結(jié)構(gòu)，所以在進行雜交等反應時，首先應加熱變性，破壞二級結(jié)構(gòu)。,在解旋酶的作用下，打開DNA雙鏈在特定的復制起始點以每條DNA鏈為模板在DNA聚合酶的催化下以4種脫氧核苷酸為前體物，合成一條互補DNA鏈。DNA的復制雙稱為半保留復制。,DNA的復制,DNA半保留復制,DNA在復制起始點，由解旋酶打開雙鏈，形成復制叉，合成新鏈的方向為5’3’端前導鏈與后隨鏈后隨鏈的合成是不連續(xù)的。先合成RNA引物再合成不連續(xù)的小片段岡崎片段，100～1000核苷酸長度最后在DNA連接酶作用下，將小片段連接起，形成完整的DNA鏈。,DNA半不連續(xù)復制,DNA的復制給了我們一些啟示①PCR技術(shù)的原理在體外要靠溫度90℃以上打雙鏈，而不是解旋酶，也是以DNA為模，需要引物，需DNA聚合酶，需要DNTP為前體。PCR與體內(nèi)細胞內(nèi)DNA復制的最大差異是溫度。②檢測核分裂指數(shù)在細胞培養(yǎng)中，加入3H標記的DNTP前體物，被細胞攝取后，參與DNA復制，復制速度越快，參入的3H標記的DNTP越多，可用液閃計數(shù)儀檢測放射性強度，據(jù)此判斷。,遺傳信息的傳遞是DNA→RNA→多肽蛋白質(zhì)在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，RNA可形成CDNA，然后再由RNA→蛋白質(zhì)以上就是完整的中心法則理論，亦可稱為基因的表達EXPRESSION。,中心法則,中心法則,,轉(zhuǎn)錄TRANSCRIPTION以DNA為模板，合成RNA的過程。非模板鏈稱為有意義鏈，而模板常稱為反義鏈。轉(zhuǎn)錄的過程大致是這樣的以DNA一條鏈為模板，誘導RNA聚合酶活性、RNA聚合酶識別并結(jié)合在轉(zhuǎn)錄起始位點以ATP、GTP、CTP和UTP為前體，合成轉(zhuǎn)錄RNA當遇到轉(zhuǎn)錄終止信號時，轉(zhuǎn)錄即停止。,有意義鏈,反義鏈,,,轉(zhuǎn)錄后的初級產(chǎn)物剪切掉內(nèi)含子，并將外顯子連接起來，這樣才能變成成熟的RNA分子還需要在5’端加一個特殊的核苷酸，7甲基鳥嘌呤核苷酸，這個過程叫戴帽另外，MRNA的，這一過程又叫穿靴，3’端還要加上一串腺苷酸AMPPOLYA或多聚腺苷酸化。同一機體不同的細胞具有相同的DNA或基因，但基因在不同細胞的表達是不同的，具有組織特異性，使不同的細胞具有不同的功能,由RNA→蛋白質(zhì)的過程，又叫翻譯。只有聚合酶II催化的反應產(chǎn)物是MRNA，而只有MRNA才翻譯成蛋白質(zhì)。基因DNA上三個相鄰的堿基組成一個密碼子，一個密碼子決定一種特定的氨基酸，共有4364個密碼子。在轉(zhuǎn)錄過程中，基因上的三聯(lián)密碼子轉(zhuǎn)錄成MRNA上的三聯(lián)密碼子。MRNA由核內(nèi)轉(zhuǎn)移至細胞漿中的核糖體上，以三聯(lián)密碼子指導合成蛋白質(zhì)。翻譯后的蛋白質(zhì)需要加工修飾。,中心法則給了我們一些啟示,①遺傳信息由DNA上的基因決定。一旦基因發(fā)生突變，將最終導致所翻譯的蛋白質(zhì)發(fā)生改變，從而導致生理功能改變，甚至出現(xiàn)疾病，如癌癥、肥胖等。②MRNA更能準確簡便地反映DNA上基因所攜帶的遺傳信息。因此對基因序列的分析，常分析MRNA的序列即可。,③基因的表達有組織特異性，且受許多因素的影響，使MRNA的表達增強、降低甚至關(guān)閉，從而影響機體正常生理功能，甚至出現(xiàn)疾病。因此常需要檢測MRNA的表達的豐度含量，常用方法有NORTHERNBLOT、RTPCR。定量REALTIMEPCR等。這里需要特別強調(diào)在檢測MRNA或蛋白表達時，一定要先弄清該基因在某種組織中是否有表達。,④根據(jù)中心法則，可以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下形成CDNA，于是建立了RTPCR的方法。⑤根據(jù)MRNA的3’端有POLYA的特點，在進行反轉(zhuǎn)錄時，就以POLYA為模板設計了引物。并且純化MRNA的方法，也是根據(jù)POLYA的原理設計的。⑥根據(jù)最后的翻譯蛋白質(zhì)去向的不同，建立不同的蛋白質(zhì)提取方法，如在線粒體，在細胞核、在細胞漿、分泌到血液中。,,,,,（2）基因表達調(diào)控以乳糖操縱子學說為例乳糖操縱子的基本組成元件,,,調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因IPOⅠⅡⅢ,,,,,,,,,,,抑制基因I是阻遏物編碼區(qū)啟動基因P有CAMP受體蛋白CRP和RNA聚合酶的結(jié)合位點操縱基因O是阻遏物結(jié)合位點,ⅠΒ半乳糖苷酶結(jié)構(gòu)基因Ⅱ透過酶結(jié)構(gòu)基因Ⅲ轉(zhuǎn)乙酰酶的結(jié)構(gòu)基因,調(diào)節(jié)方式當乳糖↑時,CAMP含量增高↑→CAMP與CAP分解產(chǎn)物激活劑蛋白結(jié)合成CRP該復合物與啟動基因上對應的位點結(jié)合后使DNA雙鏈不穩(wěn)定；隨后RNA聚合酶則容易與啟動基因緊密結(jié)合；若此時操縱基因上無阻遏物，則基因被打開RNA聚合酶從DNA的5’端開始滑動，即開始轉(zhuǎn)錄，并合成了3種酶。,當葡萄糖↑→CAMP↓→CRP↓RNA聚合酶則不能與啟動基因結(jié)合，也就不能轉(zhuǎn)錄和合成3種酶。抑制基因轉(zhuǎn)錄和翻譯成阻礙蛋白，并與操縱基因結(jié)合,阻止RNA聚合酶滑動而抑制轉(zhuǎn)錄。這種情況又稱為負調(diào)節(jié)如果阻遏蛋白與誘導物結(jié)合此處為乳糖。則這個復合物不能與操縱基因結(jié)合，轉(zhuǎn)錄和翻譯就能進行。,操縱子學說擴大了基因的概念。即結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因發(fā)揮正、負調(diào)節(jié)受細胞內(nèi)外環(huán)境因素的影響。形成了基因調(diào)控和表達的概念?；虮磉_調(diào)控理論，不僅有助于理解生命現(xiàn)象的本質(zhì)，而且對基因工程的建立是至關(guān)重要。,（3）DNA重組基因工程基因工程的兩個重要工具一是內(nèi)切酶，能特異地識別DNA的堿基序列，并在DNA鏈當中將DNA切開。二是載體，如質(zhì)粒、噬菌體、病毒。載體的共同特點環(huán)狀DNA；都能專一感染某一類細胞；具有某種選擇性標記；都具有一些內(nèi)切酶位點；都能隨著染色體的復制而復制，隨著細胞分裂而擴增。,,基因工程的基本程序①取得所需要的目的基因；②將目的基因同載體連接；③再將這個重組環(huán)狀DNA引入受體細胞或稱寄主細胞；④使目的基因得以表達，即基因轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)。,第二節(jié)核酸的提取技術(shù)EXTRACTIVETECHNIQUEOFNUCLEICACID,,,1結(jié)合狀態(tài)2形態(tài)分線形和環(huán)形；分雙鏈和單鏈3分布DNA分布在細胞核和細胞；RNA分布在細胞質(zhì)、細胞核和細胞器,（一）核酸在細胞中的存在狀態(tài)和分布,（二）核酸分離提取的原則、要求1原則1應保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；2排除其它分子的污染，純度要高。2對于核酸純度的要求1對于核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；2其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子污染應降低到最低程度；3排降其它核酸分子的污染，如提取DNA時，應去除RNA，反之亦然。,3注意事項1盡量簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對核酸的破壞2減少化學因素對核酸的降解，為避免過酸、過堿對核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在PH4～10條件下進行。,3減少物理因素對核酸的降解。物理因素主要是機械剪切力，其次是高溫。機械剪切力主要來源于溶液的快速振蕩，攪拌等。常規(guī)操作溫度為0～4℃。4避免生物因素對核酸的降解。細胞內(nèi)外均存在核酸酶，尤其是RNA酶存在廣泛、穩(wěn)定，極易降解核酸。因此提取過程中，應注意采用核酸酶抑制劑和破壞方法。,三DNA的提取、純化真核細胞染色體DNA的制備提取、純化根據(jù)不同的實驗要求，可有不同的DNA提取方法，如酚抽提法，甲酰胺解聚法，玻璃棒纏繞法，異丙醇沉淀法等。但這些方法在基本原理及大致步驟上是基本相同的。而且酚抽提法比較經(jīng)典常用，下面就以此方法為例進行介紹。,酚抽提法酚抽提法的基本原理用SDS和蛋白酶K破壞和消化細胞用酚去除水相中的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)通過鹽和乙醇沉淀獲得DNA。,試劑1磷酸鹽緩沖液PBS2DNA抽提緩沖液10MMOL/LTRISCL緩沖溶液的PH值，PH80。01MOL/LEDTA金屬離子絡合劑，可抑制DNA聚合酶活性。20ΜG/ML胰RNA酶破壞降解RNA05SDS表面活性劑，破壞細胞。蛋白酶K消化細胞、破壞細胞,3．20MG/ML蛋白酶K，消化細胞，破壞細胞4．酚（用05MOL/LTRISCL，PH80飽和），主要作用是沉淀蛋白質(zhì)等5．10MOL/LNH4AC，其作用是沉淀DNA6．乙醇，其作用是沉淀DNA7．TE（TRIS和EDTA混合液），是溶解保存DNA的最好溶液8．透析液50MMOL/LTRISCL，PH8010MMOL/LEDTA，PH80,樣品前處理1生物組織新鮮的生物組織，先用剪切刀清除組織中筋膜等結(jié)締組織，吸干血液。若不能馬上進行DNA提取，可將生物組織貯存于液氮中或70℃冰箱中。A取1～3G左右的組織，用8層紗布包好，外層再包多層牛皮紙，浸入液氮中使組織結(jié)凍，取出后用木錘將其敲碎。B將敲碎的組織放入搪瓷研缽中，加入少許液氮，用研杵碾磨。需反復添加液氮。,C在離心管中加入10MLDNA抽提液，用玻璃棒邊攪動邊加入組織粉末，然后37℃保溫1小時。先加抽提液，后加組織粉末，有利于充分溶解，用玻璃棒而不用金屬棒，減小損傷DNA的機率，37℃保溫1小時，一方面有利于SDS破壞細胞，更主要是為了使溶液平衡溫度達到37℃，為下一步反應準備適宜條件。,2培養(yǎng)的細胞A收集細胞，懸浮培養(yǎng)生長的細胞；可以直接經(jīng)1500G離心4℃,10分鐘，以收集細胞；貼壁生長的細胞，用胰酶消化后再離心收集。細胞數(shù)應在5107左右。B漂洗細胞，將離心沉淀的細胞用冰預冷的PBS液或生理鹽水，漂洗1次再離心，棄上清收集細胞?？芍貜推?2次目的去除培養(yǎng)液成分和細胞分泌的蛋白C保溫，再用10MLDNA抽提液將細胞沉淀懸浮，并在37℃保溫1小時。,1消化向上述預處理好的樣品溶液中樣品溶解在DNA抽提液并保溫1小時，加入20MG/ML的蛋白酶K，至終濃度為100ΜG/ML，邊加邊用玻璃棒輕輕攪拌，使溶液至粘稠狀細胞破裂，蛋白、核酸釋放。將反應液在50℃水浴上，保溫3H，裂解細胞，消化蛋白。保溫過程中，應不時輕輕搖勻反應液。,DNA提取步驟,2加酚混勻?qū)⒎磻豪鋮s至室溫，加入等容積已飽和的酚溶液，輕輕地上下轉(zhuǎn)動離心管，混勻兩相，反復該動作10MIN，直至水相與酚相混勻并成乳狀液。若沒有達到這種效果，可用多角度振蕩器溫和地混勻1小時3離心室溫5000G，離心15MIN，使兩相分開水相在上層，酚相在下層，DNA在水相，因水溶性，帶負電荷。4取上層水相用酚重復抽提兩次，取上層水相時，應用大口徑03CM吸管，因水相粘稠,5又分兩種情況A透析處理為提取大分子量DNA200KB以上，在第3次酚抽提后，將DNA溶液裝入透析袋中，并放入4℃透析液中。每次透析液1升，換4次透析液，直至透析物OD270小于005，才算透析完畢。B沉淀處理，對于100～150KB大小的DNA提取，在第三次酚抽提后，將上層水相移入一個新的離心管中，加入02倍容積的10MOL/L乙酸銨和2倍容積95乙醇。室溫下輕輕搖動，立刻就可看到乳白色絲狀沉淀出現(xiàn)，用一個前端為鉤狀的玻璃棒挑出DNA纖維，立即放入70乙醇中漂洗2次。室溫5000G，離心5MIN，棄上清。室溫下?lián)]發(fā)殘留乙醇。但注意不要使DNA沉淀完全干燥。然后加TEPH80溶解DNA12～24H。,,6測定樣品在260NM和280NM的OD值，計算DNA含量和A260/A280比值。260NM處，是核酸的最大吸收波長，在280NM處是蛋白質(zhì)最大吸收波長。在260NM紫外線下，1OD的光密度值相當于雙鏈DNA濃度為50ΜG/ML；單鏈DNA或RNA為40ΜG/ML。因此根據(jù)核酸的OD值，計算核酸樣品的濃度或含量。,根據(jù)A260/A280比值，可判斷所提取核酸DNA的純度。DNA純度比較理想的比值是18，RNA比值是20。若DNA比值高于18，說明有RNA的污染，低于18或175，則認為是蛋白質(zhì)或酚污染。RNA比值小于20，則認為也是蛋白質(zhì)或酚的污染。DNA樣品純度不符合要求尤其是A260/A280比值小于18時可用酚或酚/氯仿和氯仿抽提23次，用乙醚除去殘留氯仿，再揮掉乙醚。最后用鹽和乙醇沉淀，用TE溶解。,本方法需要說明的幾點15107細胞提取產(chǎn)量為200ΜG左右。2對于上層水相比較粘稠，吸取上層水相時，會牽動兩相之間的蛋白質(zhì)沉淀層。此時可用吸管插到管底吸取酚相采用負壓，至蛋白質(zhì)層時，停止。并離心5000G,20分鐘，沉淀蛋白質(zhì)，吸取上清液。3由于05SDS的存在，可抑制部分胰RNA酶活性，故應加大該酶用量，一般為20ΜG/ML4所用酚，應重蒸酚，并用水飽和。,（四）RNA的分離與純化,1創(chuàng)造一個無RNA酶RNASE的環(huán)境RNA酶在環(huán)境中無處不在空氣中灰塵、微生物，人體汗液、唾液，以及各種器皿和試劑等，均存在RNASE。RNASE非常穩(wěn)定，耐熱、耐酸，耐堿。蛋白質(zhì)變性劑可使之暫時失活。RNASE活性不需要輔助因子，因此EDTA對此酶無抑制作用。,1去除外源性RNASE的污染①空氣中的細菌、霉菌等微生物都含有RNASE，所以整個操作過程應在比較清潔的環(huán)境中進行。因此有必要對操作場所的空氣進行消毒。②操作者操作應戴口罩和手套、帶帽子。③玻璃器皿常規(guī)洗凈后，應用01?PC二乙基焦碳酸鹽浸泡處理37℃，2H，再用滅菌去離子水漂洗幾次。高壓消毒去除DEPC，然后250℃烘烤4H以上或200℃干烤過夜。,④塑料器材最好使用滅菌的一次性塑料用品。EPPENDORF管，微量加樣吸頭最好是新的，使用前進行高壓消毒。⑤所有溶液應加DEPC至00501，室溫過夜，然后高壓消毒。以去除殘留的DEPC。⑥RNA提取所用的酚，應單獨配制和使用。配制飽和酚鹽溶液時，使用的水應預先以DEPC處理且高壓消毒，酚飽和以后，加入8羥基喹啉至01。8羥喹啉不但抗氧化，而且有一定的RNA酶抑制作用。,DEPC的分子式為C2H5OCOOCOOC2H5二乙基焦碳酸鹽。是一種粘性液體，對核酸酶有很強的抑制作用。作用機制是通過與蛋白質(zhì)中的組氨酸結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性。DEPC又能與RNA或單鏈DNA反應，破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤，但它破壞單鏈核酸的濃度要比使蛋白質(zhì)變性的濃度大1001000倍。使用DEPC的一個原則是，在達到使用目的后，一般要高溫處理以便破壞除掉DEPC，使DEPC不與RNA接觸。,DEPC可與TRIS發(fā)生反應，分解成CO2和乙醇，使PH值下降（所以要去除）配制TRIS溶液時，先將所用水用DEPC處理高壓消毒配完TRIS溶液后，再經(jīng)高壓消毒。DEPC與肝素聯(lián)合使用，增強使用效果。DEPC應在4℃或液氮中保存，以防降解。,2抑制內(nèi)源性RNASE的活性。細胞裂碎的同時，RNASE釋放出來。原則上應盡早去除細胞內(nèi)蛋白，加入RNASE抑制劑，力爭在提取的起始階段對RNASE活力進行有效地抑制。不同組織細胞中內(nèi)源性RNASE的數(shù)量不同，胰腺、脾組織細胞中RNASE的含量極為豐富，在對這些組織提取RNA時，更要使用強有力的RNASE抑制劑。,抑制劑可分為以下幾類①低特異性RNASE抑制劑，如皂土、復合硅酸鹽、肝素、多胺等，因作用較弱，現(xiàn)已不大使用。②去除蛋白質(zhì)物質(zhì)蛋白質(zhì)變性劑，蛋白K、陰離子去污劑，常與RNA酶抑制劑聯(lián)合使用，以加強對RNASE的抑制作用。凡能破壞蛋白質(zhì)的物質(zhì)，對RNASE均有一定作用，因為酶本身就是蛋白質(zhì)。,A酚、氯仿這類有機溶劑不但能使核蛋白與核酸解聚但不能破壞核酸，而且對蛋白質(zhì)有變性作用。因而對酶RNASE有抑制作用。酚不能完全抑制RNASE活性，但酚一般都加入了8－羥基喹啉一種抗氧化劑，一種指示劑，因而加強了對RNASE的抑制效果。氯仿的抑制效果比較強，因此酚與氯仿常聯(lián)合使用。蛋白酶K也能抑制RNASE活性。有一種情況挺特殊，即該酶在1－2％的SDS存在下，其活性反而會增加。,B去污劑包括SDS十二烷基硫酸鈉，十二烷酰肌氨酸鈉，脫氧膽酸鈉等陰離子去污劑。這些陰離子去污劑可使核酸與蛋白質(zhì)解聚，并可與蛋白質(zhì)側(cè)鏈上帶正電荷的基團結(jié)合，在高濃度KCL存在下，形成SDS－蛋白質(zhì)復合物而沉淀。C解偶劑（胍類）鹽酸胍，異硫氰酸胍，作用非常強的一種蛋白變性劑，可完全破壞蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，從而使細胞結(jié)構(gòu)降解，核酸與核蛋白分離，所以又稱解偶劑。,③RNASE的特異抑制劑ARNASE阻抑蛋白RNASIN，是一種酸性糖蛋白可與RNASE以非共價鍵的形式結(jié)合，從而抑制RNASE活性，RNASIN最好不與蛋白質(zhì)變性劑一同使用，因變性劑亦可破壞RNASIN，從而使其喪失作用。但可與二巰基乙醇一同使用，可增強RNASIN的使用效果。B氧釩核糖核苷復合物，這也是一種RNASE特異性抑制劑，幾乎可完全抑制RNASE的活性。為達到完全、徹底抑制RNASE活性的目的，常聯(lián)合使用，而且有些抑制劑去除蛋白質(zhì)物質(zhì)一般有4種作用；破壞細胞膜，使核酸與蛋白質(zhì)分離，沉淀蛋白質(zhì)、抑制RNASE活性。因此幾乎包括了RNA提取、分離、純化的所有目的。,2RNA的分離、提取方法步驟1創(chuàng)造一個無RNASE環(huán)境；2組織或細胞的勻漿，同時得加入RNASE抑制劑3裂解細胞；4去除蛋白、DNA等大分子物質(zhì)；5沉淀RNA；6漂洗；7溶解RNA。,酚使核酸與核蛋白分離、變性沉淀蛋白質(zhì)，抑制RNASE活性。異硫氰酸胍破壞裂解細胞，使核酸與核蛋白分離，變性沉淀蛋白質(zhì)，同是具有很強的RNASE抑制作用。這是一個關(guān)鍵的試劑，由于它是萬能的，所以實驗步驟變得簡單。,TRIZOL試劑盒所提供的試劑,自己需要配制的試劑,氯仿蛋白質(zhì)變性作用，增強對RNASE抑制作用。異丙醇沉淀RNA。75％乙醇漂洗、去除鹽、殘留有機溶劑等雜質(zhì)。無RNASE水或05SDS溶液后者較好必須用DEPC處理。,①勻漿化A組織取50100MG組織放在勻漿管中，加1MLTRIZOL試劑，然后進行勻漿，此時裂解細胞和RNASE抑制同時進行。B貼壁生長細胞倒掉培養(yǎng)液，然后直接向培養(yǎng)瓶皿中加

簡介：分子生物學與臨床天津市第三中心醫(yī)院劉樹業(yè),隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，聚合酶鏈反應（PCR）技術(shù)已逐漸應用于遺傳性疾病、腫瘤及感染性疾病等方面的診斷。1檢測臨床標本中病原體核酸序列。2腫瘤基因突變情況。3遺傳性疾病的基因序列。4人類白細胞表面抗原（HLA）配型。5法醫(yī)學方面的鑒定工作。,,PCR技術(shù)在臨床實驗室應用的價值,,優(yōu)點1靈敏度高，理論上，只要標本中含有一個分子的DNA或RNA就可以作出診斷。2特異性強，對于一個19核苷酸的引物來說，非特異性配對的概率為4192751011這表示要與這19個堿基的排列順序完全相同時需要的基因組DNA片段的最小長度，而人的基因組長度為3109堿基對，以克服血清學診斷有交叉反應的缺陷。3可以早期診斷，如在HCV的感染中，第一周內(nèi)就可以檢測出HCVRNA，而抗體的產(chǎn)生一般在第二周以后。,PCR在診斷病原體感染時的優(yōu)缺點,4對于體液免疫力低下或使用免疫抑制劑而無抗體產(chǎn)生者，PCR卻可以作出明確診斷。5可以對病原體作定量分析，反映病原體在機體的復制及動力學變化情況。6可對病原體進行基因分型。指導臨床治療。,,,不足之處,1操作復雜，技術(shù)不易被熟練掌握。2價格昂貴。3出于敏感性太高，操作步驟多而復雜，即使有極少量的污染也會造成假陽性。4由于操作復雜，對試劑及實驗條件要求嚴格，稍有差錯就會出現(xiàn)假陰性。,幾點認識,一今后儀器和試劑的發(fā)展方向封管、定量及自動化；二樣品采集方式對PCR很重要，比操作更重要。三內(nèi)標作用操作過程的監(jiān)控、控制假陰性。四從核酸提取、擴增到檢測，對照與待測標本同步進行；,,五禁用產(chǎn)物的電泳分析技術(shù)。六探針雜交技術(shù)和防污染技術(shù)的采用是一大進步。,,,一標本的采集,常用于基因擴增檢測的臨床標本包括EDTA或枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。采血液等樣本時，應使用一次性密閉容器，如真空采血管。當使用非密閉采樣系統(tǒng)時，如尿、分泌物和骨髓的采樣，必須注意防止來自采樣者皮屑或分泌物的污染。采樣時必須戴一次性手套。玻璃器皿在使用前應高壓處理，因為玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是熱滅菌，250℃烘烤4小時以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨髓標本必須進行抗凝處理。EDTA和枸櫞酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝，因為肝素是TAQ酶的強抑制劑，而且在其后的核酸提取步驟中很難去除。臨床用于RNA（如HCVRNA）擴增檢測的血標本建議進行抗凝處理，并盡快（3小時以內(nèi)）分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝處理，則抽血后，必須在1小時內(nèi)分離血清。,,二標本的穩(wěn)定化處理,用于DNA擴增檢測的標本，采集后一般不需特殊的穩(wěn)定化處理，但標本應及時送至實驗室。由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA測定的標本有時必須進行穩(wěn)定化處理，如流行病學調(diào)查的現(xiàn)場采樣。異硫氰酸胍鹽（GUANIDINETHIOCYANATE,GITC）可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集標本時，可將標本材料如血清或血漿按1∶4的比例加至含有5MOL/LGITC的試管內(nèi)中，從而使血清（漿）中的RNA酶不可逆失活。經(jīng)上述穩(wěn)定化處理后，標本一般不需要冷藏即可郵寄。對于特定的檢測項目，上述穩(wěn)定化處理方法的效果究竟如何，要使用相應的逆轉(zhuǎn)錄PCR測定方法來評價。,,三標本的運送,標本采集后必須盡快送至實驗室。經(jīng)過適當穩(wěn)定化處理的標本可在常溫下通過郵寄運送。如用于DNA擴增檢測的EDTA抗凝全血標本及用于RNA擴增檢測的經(jīng)GITC穩(wěn)定化處理的標本，通常在運送時，應采用不易破碎的容器裝載標本。用于RNA檢測的標本，如果未經(jīng)穩(wěn)定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運送。,,四標本的貯存,臨床體液標本如血清/血漿等可于70℃下長時間貯存。用于DNA測定的已純化核酸樣本可在10MMOL/LTRIS1MMOL/LEDTA緩沖液（PH7580）中4℃保存，用于RNA測定的已純化核酸樣本應在緩沖液中80℃或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在20℃即可。用GITC處理的RNA標本在室溫可保存7天。,,五標本的處理（核酸提取）,標本處理即核酸提取純化是決定擴增檢測成敗的關(guān)鍵性步驟，在使用商品核酸提取試劑提取臨床標本中的核酸模板前，應對其進行充分評價以驗證其提取的有效性。通常，核酸制備質(zhì)量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能來源于標本本身（如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物）或核酸提取過程中殘留的有機溶劑（如酚、氯仿等），這些物質(zhì)對其后的TAQ酶擴增反應步驟具有強烈的抑制作用，從而影響靶核酸的擴增測定。當標本為痰時，則必須先進行液化處理，再提取核酸。需注意的是，液化時不能加熱，液化時間不能過長。此外，當靶核酸為RNA時，逆轉(zhuǎn)錄PCR測定失敗的常見原因是標本在運送前未經(jīng)充分的穩(wěn)定化處理血清或血漿按1∶4的比例加至含有5MOL/LGITC的試管內(nèi)中，從而使血清（漿）中的RNA酶不可逆失活及核酸提取試劑的RNA酶的污染。對于前者，要核查測定分析前的步驟，如果發(fā)現(xiàn)有RNA降解的證據(jù)，實驗室則應拒絕接受標本，要求重新采取標本，并對運送者給以詳細的指導。對于后者，建議使用高質(zhì)量的商品核酸提取試劑。,,一內(nèi)源性物質(zhì)影響因子）,1類風濕因子2補體3嗜異性抗體4嗜靶抗原的自身抗體5醫(yī)源性誘導的抗鼠IGS抗體6交叉反應物質(zhì)7標本中其它成分的影響,二外源性物質(zhì),1標本溶血2標本受細菌污染3標本保存不當4標本凝集不全5標本管中添加物質(zhì)的影響,,PCR測定的臨床應用及測定結(jié)果的臨床意義,結(jié)核分支桿菌病原學結(jié)核分支桿菌復合群（MTBC）人型結(jié)核分支桿菌、牛型結(jié)核分支桿菌、非洲型結(jié)核分支桿菌和田鼠型結(jié)核分支桿菌，后者無致病性。對人有致病性的主要是人型結(jié)核分支桿菌，牛型引起人類發(fā)病已很少見。此外分支桿菌報道有100余種，1994年國際公認有56種，常用非結(jié)核分支桿菌（NTM）或其他分支桿菌（MOTT）的名稱。培養(yǎng)1520小時一代，24周看到培養(yǎng)基上的菌落。抗菌治療后需48周或20周才出現(xiàn)菌落。,,引物設計結(jié)核分支桿菌共有的靶序列65KD人型結(jié)核分支桿菌特異的靶序列MPT40MTBC特有的靶序列，如IS6110插入序列RRNA序列，以16SRRNA為模板CDNA擴增，高度保守，TB有高達100010000拷貝數(shù)，具很高的靈敏度和特異性。注意問題標本處理痰、胸腹水液化劑，紅細胞裂解液,,臨床應用評價TB與其他分支桿菌區(qū)別AIDS鳥分支桿菌，龜分支桿菌TB耐藥基因含菌量較低標本分離TB敏感性遠高于直接涂片和培養(yǎng)涂片鏡檢10000100000菌/ML，培養(yǎng)10100個活菌PCR120個結(jié)核桿菌，但不能鑒別死菌和活菌，不能反映抗結(jié)核治療的效果；還可見臨床無結(jié)核病證據(jù)涂片和培養(yǎng)均陰性而PCR陽性的情況，這在理論上可診斷結(jié)核，但臨床上很難被醫(yī)師認同，這涉及所謂金標準的問題，目前還遠不能就此情況下PCR陽性的生物學意義和價值作出評價。,,沙眼衣原體CHLAMYDEATRACHOMATISCT,病原學三個生物變種沙眼生物變種AK12個血清型性病淋巴肉牙腫變種LGV3個血清型，人是天然宿主鼠生物變種鼠是天然宿主，不侵犯人，與鼠肺炎有關(guān)病原學檢驗涂片、抗原抗體檢測、核酸檢測,四種衣原體的性狀比較,,PCR16SRRNA基因高度保守衣原體屬特異引物75KD質(zhì)粒及MOMP主要外膜蛋白基因適于構(gòu)建種或型特異性引物根據(jù)沙眼衣原體內(nèi)源性質(zhì)粒序列設計合成的一對引物1GGACAAATCGTATCTCGG2GAAACCAACTCTACGCTG擴增片段517,可擴增15個已知血清型的沙眼衣原體實驗證明,此引物不擴增其他眼部常見微生物和正常人核酸,而對臨床49例診斷為沙眼的標本陽性率為63,敏感性和特異性均超過細胞培養(yǎng)法和免疫熒光法與酶免疫法等常規(guī)方法,靈敏度達到能檢出1個衣原體DNA分子,,特別要注意的問題取材一定要取到細胞臨床評價金標準培養(yǎng)免疫學熒光主觀判定EIA金葡、鏈球菌、淋球菌交叉反應PCR假陰陽性,,人類組織相容性抗原HLA,組織相容性（主要組織相容性復合體MHC）系統(tǒng)的概念有I、II、III類I類HLAA，HLAB，HLAC，HLAE，HLAF，HLAG，HLAHL等II類HLADR，HLADQ，HLADP，HLADO，HLADN，HLAM,等位點III類為補體系統(tǒng)C2，C4，BF等。HLA抗原的分類I類和II類抗原多態(tài)性、共顯性遺傳已發(fā)現(xiàn)的HLA基因位點等位基因數(shù)約400左右,,HLA分型的基本方法血清學方法基本原理活的淋巴細胞表面有大量的HLAA,HLAB,HLACHLADR抗原,在與特異性的同型抗體結(jié)合后,有補體存在時會被殺死,經(jīng)過染色，根據(jù)淋巴細胞被殺死的百分率,可以決定待測淋巴細胞是否具有某一特異性的抗原細胞學方法基本原理檢測的抗原屬于HLADP，HLADQ兩個位點，如果兩種淋巴細胞表面抗原不同,在一起培養(yǎng)，不同抗原互相刺激，淋巴細胞增殖并向母細胞轉(zhuǎn)化；否則，這兩種細胞會保持不變。,,HLA分型的基本方法常用X射線處理已知HLADP，HLADQ特異淋巴細胞，失去增殖能力保持刺激能力，與待測淋巴細胞混合培養(yǎng)，若不發(fā)生增殖和母細胞化即認為與已知特異性細胞同型，否則為不同型別淋巴細胞HLADR基因分型例序列特異性引物PCR法合成19對引物,21管加公共引物DR型別,,HLA抗原一HLAABC抗原與疾病相關(guān)HLAA,B與器官移植的關(guān)聯(lián)沒有D的配型意義顯著,C無意義二HLAD抗原與器官移植配型相關(guān)DR座位上的等位基因數(shù)比AB座位上的少,在隨機人群中挑選到DR抗原配合的供體要比選擇AB抗原配合的供體容易,所以目前器官移植主要做DR配型,,遺傳病檢測,遺傳病是由基因在性細胞的突變引起的一。PCR結(jié)合等位基因特異性寡核苷酸探針法對已知突變熱點基因檢測PCR目的基因膜雜交發(fā)現(xiàn)突變位點合成正常及突變寡核苷酸探針一個等位基因有一種ASO探針,要證明待測標本是否屬于這一等位基因,要進行一次雜交顯示信號的操作,這對于致病基因有多個突變可能性的診斷地中海貧血在中國有18種突變類型,全球有100多種,操作繁雜甚至不可能二。PCR擴增特異等位基因在3’末端設計突變位點,根據(jù)特異性PCR產(chǎn)物出現(xiàn)與否判斷突變的存在,,,,三限制性片段長度多態(tài)性分析突變位點與酶切位點相關(guān)出現(xiàn)新的電泳圖譜四單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析SSCP①PCR擴增靶DNA②將特異的PCR擴增產(chǎn)物變性，而后快速復性，使之成為具有一定空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA分子③將適量的單鏈DNA進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳④最后通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結(jié)果若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA帶遷移率與正常對照的相比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構(gòu)象發(fā)生改變，進而推斷該DNA片段中有堿基突變該方法簡便、快速、靈敏，不需要特殊的儀器，適合臨床實驗的需要,,,不足之處例如，只能作為一種突變檢測方法，要最后確定突變的位置和類型，還需進一步測序電泳條件要求較嚴格另外，由于SSCP是依據(jù)點突變引起單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變來實現(xiàn)電泳分離的，這樣就可能會出現(xiàn)當某些位置的點突變對單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變不起作用或作用很小時，再加上其他條件的影響，使聚丙烯酰胺凝膠電泳無法分辨造成漏檢盡管如此該方法和其他方法相比仍有較高的檢測率首先，它可以發(fā)現(xiàn)靶DNA片段中未知位置的堿基突變TAKAO，經(jīng)實驗證明小于300BP的DNA片段中的單堿基突變，90可被SSCP發(fā)現(xiàn)，他認為現(xiàn)在知道的所有單堿基改變絕大多數(shù)可用該方法檢測出來另外，SSCP方法可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈DNA分離，并且還可以進一步提純用這種方法可以最終從DNA序列水平上鑒別突變DNA片段,,UNG酶/DUTP防污染系統(tǒng),本試劑盒中加入了DUTP以保證PCR只選擇性地擴增臨床中的靶DNA。UNG酶（尿嘧啶糖基化酶）能識別并催化酶解含有DUTP的DNA結(jié)構(gòu)，但不會對含有DTTP的DNA的結(jié)構(gòu)識別并催化酶解。DUTP不存在于自然的DNA中，只有運用DUTP替代DTTP的PCR反應之中產(chǎn)生的擴增子中存在。這種DU化的PCR產(chǎn)物與UNG酶一起孵育后使其失去再被擴增的能力，因UNG可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N糖苷鍵，可去除DU，使無DU的位點阻止TAQDNA聚合酶的延伸。UNG酶可從單鏈或雙鏈DNA中消除尿嘧啶，而對RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無作用。UNG酶在正常PCR循環(huán)變性一步就可被滅活，所以對含DU的新的PCR產(chǎn)物沒有影響。,,腫瘤研究中的分子生物學,腫瘤分為癌,肉瘤,白血病/淋巴瘤癌90的人類腫瘤,起源內(nèi)胚層及外胚層上皮細胞肉瘤,白血病/淋巴瘤起源中胚層細胞,包括肌肉,骨骼,血管,成纖維細胞以及血液和淋巴系統(tǒng)中的循環(huán)細胞腫瘤發(fā)展的多步性病毒癌基因腫瘤病毒,,有致癌能力的DNA病毒6個病毒家族乙肝病毒,猴病毒40,多瘤病毒,乳頭瘤病毒,皰疹病毒,痘病毒只有一類RNA病毒致癌反轉(zhuǎn)錄病毒腫瘤抑癌基因的發(fā)現(xiàn)HANIS1960年,正常細胞與腫瘤細胞融合雜合體細胞不致瘤正常細胞中具有腫瘤抑制基因產(chǎn)生腫瘤表型的負調(diào)節(jié)物當雜合體細胞某段染色體丟失后細胞變?yōu)槟[瘤表型這段染色體上有重要的腫瘤抑制基因,,抑癌基因P53多種腫瘤早期發(fā)現(xiàn)腫瘤中P53表達增加,認為是癌基因正常P53基因抑制腫瘤形成,腫瘤中過量表達的是P53基因突變體作為顯性抑制物影響P53功能致癌P16,PTP多種抑癌基因WT1腎母細胞癌DCC結(jié)腸癌APC家族性腺瘤息肉癌變廣義的講,許多在細胞繁殖中起正常作用的基因,如DNA修復基因，其突變也會導致腫瘤的發(fā)生,它們的存在間接地起到抑制腫瘤的作用,,臨床評價1、假陽性與假陰性2、陽性率與“金標準”3、臨床實踐是最重要的依據(jù),,遺傳病診斷,?地中海貧血珠蛋白序列中的的十幾種點突變；3’堿基特異的PCR或ASO?地中海貧血16號染色體珠蛋白序列中基因簇的三種大片段缺失；每條染色體上各有兩個緊密連鎖的?基因，故一對16號染色體上共有四個?珠蛋白基因（??/??）缺失1個?基因?珠蛋白合成障礙性貧血缺失2個?基因?0珠蛋白合成障礙性貧血缺失3個?基因HBH病缺失4個?基因（全部缺失）HBBART’S胎兒水腫綜合癥非缺失型?珠蛋白合成障礙性貧血不終止HBCONSTANTSPRING,,,遺傳病診斷,甲型血友病X連鎖隱性遺傳病，（長距離PCR技術(shù)）唐氏綜合癥（21三體）三體形成配子期；智力低下，1/800全基因組分析法多個具有多態(tài)性的位點進行連鎖分析。,,,生物芯片PCR技術(shù)在HLADRB1基因配型中的應用序列特異性引物PCR（SSPPCR）,基因診斷是指檢測感染者體內(nèi)病毒核酸的有無,或含量多少來進行病原學診斷的一類方法。病毒性肝炎基因診斷包括病毒基因種類及含量、基因分型、亞型和變異及準種等的診斷。甲型肝炎和戊型肝炎無慢性化,且有較好的血清學診斷指標,故一般不需進行基因診斷。HGV和TTV,病毒性肝炎的基因診斷,定性和定量PCR定性檢測主要是用于未知感染者的診斷,確定患者是否感染了肝炎病毒,結(jié)果分別報告為“陽性“或“陰性“。定量測定己知感染者的抗病毒治療時動態(tài)觀察療效,結(jié)果報告需以量來表示。如高出定量范圍上限，則需對標本稀釋后再測,低于定量范圍下限時,則報告小于COPIES/ML,不能以“陰性“形式報告。,病毒性肝炎的基因診斷,肝炎病毒,甲型肝炎病毒與戊型肝炎病毒由消化道傳播，引起急性肝炎，不轉(zhuǎn)為慢性肝炎或慢性攜帶者。乙型與丙型肝炎病毒主要由輸血、血制品或注射器污染而傳播，除引起急性肝炎外，可致慢性肝炎，并與肝硬化及肝癌相關(guān)。丁型肝炎病毒為一種缺陷病毒戊型肝炎病毒（HEV）庚型肝炎病毒（HGV）TT型肝炎病毒（TTV）SEN型肝炎病毒（HSV）,甲型肝炎病毒（HEPATITISAVIRUS，HAV）,,HAV的生物學性狀,屬小RNA病毒科，直徑27NM，無包膜呈20面立體對稱外面為一獨立外殼，內(nèi)含一個單鏈RNA分子,HAV的電鏡照片,FEINSTONE（1973）,HAV的結(jié)構(gòu),HAV的致病性,糞－口途徑傳播,口咽部或唾液腺中早期增殖,腸道與局部淋巴結(jié)中大量增殖,入血并形成病毒血癥,肝臟為最終靶器官（病毒直接損傷或免疫病理作用）,通過膽汁隨糞便排出體外,,,,,,,HAV的免疫性,HAV只存在單一的抗原抗體系統(tǒng)，即HAVAG和抗HAV無論顯性感染還是隱性感染均能誘生出高效價抗HAV抗HAVIGM陽性是甲肝的確診依據(jù)IGM型抗體在感染后僅持續(xù)存于36個月IGG型抗體則可存在多年,TIMECOURSEOFHAVINFECTION,HAV的其他生物學特性,培養(yǎng)特性原代肝細胞或恒河猴胚腎傳代株細胞對HAV敏感，生長緩慢，不引起細胞裂解抵抗力比腸道病毒更耐熱，60℃1H不被滅活，100OC5分鐘可滅活對乙醚、酸處理（PH3）均有抵抗力氯消毒、紫外線照射、福爾馬林處理均可破壞其傳染性,常見癥狀,流感樣癥狀厭食惡心黃疸（眼部及皮膚呈黃色）尿黃腹痛乏力,微生物學檢查,感染早期可檢測血清中的抗－HAVIGM流行病學調(diào)查可檢測抗－HAVIGG對已接種甲肝疫苗者檢測中和型抗－HAV抗體直接檢測抗原或用分子生物學方法檢測病毒RNA,乙型肝炎病毒（HEPATITISBVIRUS,HBV）,,HBVDNA,病原學HBV屬嗜肝DNA病毒科，部分雙鏈DNA，3200堿基對，10個亞型，序列表明不同亞型的變異為10，同一亞型的變異為2。檢測病原體抗原、抗體核酸臨床評價,,HBV的基因組結(jié)構(gòu),32KB不完全雙鏈環(huán)狀DNA，含4個ORF,,,可將微孔板包被有蛋白質(zhì)（如親和素或鏈霉親和素、抗DIG抗體、牛血清白蛋白）或已知序列的核苷酸，此為通用型活化微孔板，任何探針末端只要含有相應配體或與已知序列互補的核苷酸都可與相應的活化微化板固相化。我們設計了HBV特異探針，其端含段與通用板已知序列互補的核苷酸，引物5端修飾有生物素，HBVDNAPCR產(chǎn)物與固相化探針雜交后，即可用酶標親和素進行酶呈色測定，并證實其測定敏感度至少高于普通電泳法100倍。,,HBVDNA定量測定的臨床意義,為臨床診斷提供更全面、精確的資料真實、全面地反映HBV感染、復制及病情變化過程抗病毒治療的分子水平監(jiān)測用HBVDNA的血清濃度的變化來評價抗病毒藥物的療效,,①熒光探針1②熒光探針2③引物④PCR擴增產(chǎn)物⑤TAQ酶,擴增及檢測原理,A變性，雙鏈模板裂解成兩條單鏈,B退火，引物、熒光探針分別結(jié)合到單鏈模板的相應位點，探針①3’端激發(fā)基團和探針②5’端的發(fā)光基團緊靠在一起，發(fā)出640NM的熒光,C延伸，隨聚合反應的進行，結(jié)合在模板上的2條熒光探針被替換下來。,D一個循環(huán)結(jié)束，生成2條雙鏈模板,,,不同臨床標本組中的HBVDNA檢出率,,不同臨床標本組中HBVDNA陽性的定量結(jié)果,,,,,,,,電鏡下的HBV,DANE顆粒,HBV的小球形顆粒,HBV的管形顆粒,HBV的復制,HBV的抗原組成,表面抗原HBSAG核心抗原HBCAGE抗原HBEAG,表面抗原HBSAG,存在于三型顆粒中是HBV感染的主要標志分亞型（A,D/Y,W/R,ADR）產(chǎn)生抗HBSPRES1、PRES2及抗PRES1和抗PRES2,核心抗原HBCAG,僅存在于DANE顆粒中不易在血液中檢出可在感染的肝細胞表面存在刺激機體產(chǎn)生抗HBC（IGG、IGM）表明病毒在復制,E抗原HBEAG,僅存在于DANE顆粒中游離存在于血液中為病毒復制及強傳染性的指標產(chǎn)生抗－HBE，是預后良好的征象,HBV的其它生物學性狀,培養(yǎng)黑猩猩動物模型、鴨動物模型用分子生物學技術(shù)的細胞培養(yǎng)成功抵抗力抵抗力強于HAV對低溫干燥紫外線耐受不被70％乙醇滅活100℃10分鐘可滅活,HBV的致病機制,免疫低下HBSAG無癥狀攜帶者病毒變異逃逸免疫細胞介導的免疫損傷為主免疫復合物性的免疫損傷肝外損傷自身免疫反應的免疫損傷肝特異性脂蛋白抗原,HBV的傳染機制,傳染源主要傳染源是患者或無癥狀HBSAG攜帶者傳播途徑密切接觸血液及體液母嬰傳播不嚴格集體預防接種、藥物注射針刺、文身等,乙型肝炎的特點,我國約有4060人群曾受到過HBV的感染表現(xiàn)急性乙肝的僅占011，亞臨床3075，慢性乙肝15，乙肝病毒攜帶720急性乙肝如治療不徹底，10患者可轉(zhuǎn)為慢性乙肝,乙肝五項及HBVDNA的臨床意義,HBSAG、抗HBSHBEAG、抗HBE抗HBC（HBCAG）HBVDNA,乙型肝炎病毒抗原,特別是表面抗原,在血液中的濃度較高,現(xiàn)癥HBV感染明確診斷。僅抗HBC單項陽性,也可在血清中檢測到HBVDNA乙型肝炎的診斷往往不需要進行病毒核酸的檢測。抗病毒治療時,血清中的病毒核酸含量是反映病毒數(shù)量和復制活躍程度最可靠的直接指標、動態(tài)觀察藥物療效的確切指標,特別是對于HBEAG陰性患者。,,預防及免疫,控制傳染源，切斷傳播途徑人工自動免疫疫苗（血源性、基因工程人工被動免疫高效價人血清球蛋白（HBIG）,丙型肝炎病毒（HEPATITISCVIRUS）,,HCV的生物學性狀,40～60NM球形有包膜單正鏈RNA,,HCV的基因結(jié)構(gòu),,丙型肝炎的特點,我國丙肝病毒攜帶者的比例在25隨著年齡的增長，丙肝病毒攜帶率亦增高易感人群感染HCV后，慢性化的比例高達50以上乙肝患者容易重疊HCV感染,,HCV的診斷及預防,檢查病毒RNA檢測抗HCV因HCV免疫原性不強及變異，目前尚無可用疫苗,,HCVRNA,HCV是引起輸血后肝炎主要致病因子，因為血中HCV含量僅為HBV的千分之一，加之其免疫學標志僅有抗HCV一項，至今HCV分離尚不成功，其檢測較HBV困難得多，因此分子生物學方法在此應用顯得格外重要。,,丙型肝炎基因診斷及意義,結(jié)果判斷抗HCV伴ALT?，或已排除其他肝炎的慢性肝炎，可診斷為丙肝?？笻CV，ALTN。必須檢測到HCVRNA（定性）才診斷丙肝。,,丙型肝炎基因診斷及意義,結(jié)果判斷抗HCV，臨床懷疑丙肝。應做HCVRNA二次定性或有一次定量，可診斷為丙肝。常見于免疫功能低下或缺陷、少數(shù)兒童和老人。急性丙肝抗HCV檢出率為5090，應檢測HCVRNA?？共《舅幱弥委煴仨氂枚縋CR檢測反映藥物療效。,,HCVRNA,病原學單鏈正股RNA病毒基因組長度10KB，為一個連續(xù)的ORF，包含多個結(jié)構(gòu)區(qū)和非結(jié)構(gòu)區(qū)的蛋白基因。HCV變異及其亞型序列變異率在3228之間,不同國家和地區(qū)分離的毒株基因差異很大,同一患者在不同時期分離的毒株也有變異HCV基因組分為IIV型和若干亞型,,定量檢測HCVRNA1可用于急性丙肝的早期診斷,在HCV陽性之前2可作為HCV感染有無傳染性的指標3作為抗病毒療效的指標,HCV的生物學性狀,40～60NM球形有包膜單正鏈RNA,HCV的致病性與免疫性,傳播途徑似HBV是引起輸血后慢性肝炎和肝硬化的主要原因潛伏期48周無癥狀HCV攜帶者和慢性丙肝者多見誘發(fā)肝外損傷腎小球腎炎免疫力不牢固,丙型肝炎的特點,我國丙肝病毒攜帶者的比例在25隨著年齡的增長，丙肝病毒攜帶率亦增高易感人群感染HCV后，慢性化的比例高達50以上乙肝患者容易重疊HCV感染,HCV的診斷及預防,檢查病毒RNA檢測抗HCV因HCV免疫原性不強及變異，目前尚無可用疫苗,HCV的診斷及預防,丙型肝炎病毒中國普通人群抗ＨＣＶ抗體的陽性率為32全世界約17億人感染了ＨＣＶ目前除了干擾素ΑＩＦＮΑ或其與利巴韋林聯(lián)合應用對部分患者有一定療效疫苗研究由于ＨＣＶ包膜糖蛋白Ｅ2中和性抗原位點存在高變區(qū)1ＨＶＲ1進展甚微,ＨＣＶ抗原表位線性表位、空間表位。如果以ＨＣＶ特異性抗體對化學合成的隨機噬菌體多肽庫進行篩選,則很難篩選到與原始的抗原序列完全一致的序列,而是獲得大量與原始抗原序列完全不同的多肽片段。這種一級結(jié)構(gòu)序列與原始抗原不同,又保留其抗原反應性的抗原表位,稱為模擬表位ＭＩＭＯＴＯＰＥ。從其結(jié)構(gòu)而言,模擬表位多數(shù)是構(gòu)象表位ＣＯＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮＡＬＥＰＩＴＯＰＥ,即空間表位。噬菌體表面展示技術(shù)的建立和應用促進了ＨＣＶ抗原模擬表位的研究。國外學者應用噬菌體表面展示技術(shù)篩選獲得了ＨＣＶ不同的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白抗原的模擬表位。這些研究結(jié)果首先在免疫學理論上闡明了抗原抗體分子之間相互對應的多樣性的問題,同時由于模擬表位的抗原性較強,且具有廣譜性,因此,在新型診斷試劑和廣譜疫苗的研究中具有重要的應用前景。,,HCV的診斷及預防,丙型肝炎病毒感染的診斷,

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