簡介：分子生物學(xué)ADENINEA腺嘌呤BASE堿基GUANINEG鳥嘌呤NUDEOTIDE核苷酸CYTOSINEC胞嘧啶NUCLEOSIDE核苷URACILU尿嘧啶THYMINET胸腺嘧啶BASEPAIR堿基對PHOSPHODIESTERLINKAGE磷酸二酯鍵NUCLEOSOME核小體RIBOSOME核糖體RIBOSOMALRNARRNA核糖體RNATRANSFERRNATRNA轉(zhuǎn)運(yùn)RNAMESSENGERRNAMRNA信使RNATHECENTRALDOGMA中心法則SEMICONSERVATIVEREPLICATION半保留復(fù)制DNADEPENDENTDNAPOLYMERASE依賴DNA的DNA聚合酶MITOCHONDRIADNA線粒體DNAEXONUCLEASE核酸外切酶INCPATION摻入HELICASE解螺旋酶DNATOPOISOMERASEDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶SINGLESTREDDNABINDINGPROTEIN單鏈DNA結(jié)合蛋白GYRASE旋轉(zhuǎn)酶PRIMOSOME引發(fā)體PRIMASE引物酶DNALIGASEDNA連接酶IGIN起始點(diǎn)BIDIRECTIONALREPLICATION雙向復(fù)制REPLICON復(fù)制子LEADINGSTR領(lǐng)頭鏈LAGGINGSTR隨從鏈OKAZAKIFRAGMENT岡崎片段ROLLINGCIRCLEREPLICATION滾環(huán)復(fù)制TELOMERASE端粒酶MUTATION突變NUCLEASE核酸酶SALVAGEPATHWAY補(bǔ)救合成DENOVOSYNTHESIS從頭合成URICACID尿酸INOSINE肌苷ELONGATIONFACT延長因子STREPTOMYCIN鏈霉素TETRACYCLINE四環(huán)素CHLOMYCETIN氯霉素PUROMYCIN嘌呤霉素CYCLOHEXIE防線菌酮PROMOTER啟動子LACOPERON乳糖操縱子TEMPALSPECIFICITY時間特異性SPATIALSPECIFICITY空間特異性HOUSEKEEPINGGENE管家基因CONSTITUTIVEEXPRESSION組成性基因表達(dá)INDUCTION誘導(dǎo)REPRESSION阻遏OPERAT操縱序列CISACTINGELEMENT順式作用元件TRANSACTINGFACT反式作用因子REPRESS阻遏物ACTIVAT激活物CATABOLITEGENEACTIVATIONPROTEINCAP分解代謝物基因激活蛋白ATTENUATION轉(zhuǎn)錄衰減ATTENUAT衰減子ENHANCE增強(qiáng)子GENERALTRANIONFACT基本轉(zhuǎn)錄因子ZINCFINGER鋅指TRANSFMATION轉(zhuǎn)化TRANSFECTION轉(zhuǎn)染TRANSDUCTION轉(zhuǎn)導(dǎo)TRANSPOSITION轉(zhuǎn)座TRANSPOSON轉(zhuǎn)座子RECOMBINATION重組HOMOLOGOUSRECOMBINATION同源重組CLONE克隆CLONING克隆化COPY拷貝GEICENGINEERING基因工程RESTRICTIONENDONULEASE限制性內(nèi)切酶CLONINGRECT基因載體PLAS質(zhì)粒COMPLEMENTARYDNA，CDNA互補(bǔ)DNAMOLECULARMEDICINE分子醫(yī)學(xué)GENETHERAPY基因治療GENOMICDNALIBRARY基因組DNA文庫

簡介：現(xiàn)代分子生物學(xué)復(fù)習(xí)資料現(xiàn)代分子生物學(xué)復(fù)習(xí)資料第一章第一章緒論緒論分子生物學(xué)分子生物學(xué)是研究核酸、蛋白質(zhì)等所有生物大分子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及其重要性、規(guī)律性和相互關(guān)系的科學(xué)分子生物學(xué)的主要研究內(nèi)容分子生物學(xué)的主要研究內(nèi)容1、DNA重組技術(shù)2、基因表達(dá)調(diào)控研究3、生物大分子的結(jié)構(gòu)功能研究結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)4、基因組、功能基因組與生物信息學(xué)研究5、DNA的復(fù)制轉(zhuǎn)錄和翻譯第二章第二章染色體與染色體與DNA半保留復(fù)制半保留復(fù)制DNA在復(fù)制過程中堿基間的氫鍵首先斷裂，雙螺旋解旋并被分開，每條鏈分別作為模板合成新鏈，產(chǎn)生互補(bǔ)的兩條鏈。這樣新形成的兩個DNA分子與原來DNA分子的堿基順序完全一樣，因此，每個子代分子的一條鏈來自親代DNA，另一條鏈則是新合成的，所以這種復(fù)制方式被稱為DNA半保留復(fù)制DNA半不連續(xù)復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制DNA雙螺旋的兩條鏈反向平行，復(fù)制時，前導(dǎo)鏈DNA的合成以5′3′方向，隨著親本雙鏈體的解開而連續(xù)進(jìn)行復(fù)制；后隨鏈在合成過程中，一段親本DNA單鏈?zhǔn)紫缺┞冻鰜恚缓笠耘c復(fù)制叉移動相反的方向、按照5′3′方向合成一系列的岡崎片段，然后再把它們連接成完整的后隨鏈，這種前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和后隨鏈的不連續(xù)復(fù)制稱為DNA的半不連續(xù)復(fù)制原核生物基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)原核生物基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1、基因組很小，大多只有一條染色體2、結(jié)構(gòu)簡練3、存在轉(zhuǎn)錄單元，多順反子4、有重疊基因真核生物基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)真核生物基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1、真核基因組龐大，一般都遠(yuǎn)大于原核生物的基因組2、真核基因組存在大量的重復(fù)序列3、真核基因組的大部分為非編碼序列，占整個基因組序列的90％以上，該特點(diǎn)是真核生物與細(xì)菌和病毒之間最主要區(qū)別4、真核基因組的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子5、真核基因是斷裂基因，有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)6、真核基因組存在大量的順式作用元件，包括啟動子、增強(qiáng)子，沉默子等7、真核基因組中存在大量的DNA多態(tài)性8、真核基因組具有端粒結(jié)構(gòu)DNA轉(zhuǎn)座（移位轉(zhuǎn)座（移位）是由可移位因子介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象DNA轉(zhuǎn)座的遺傳學(xué)效應(yīng)轉(zhuǎn)座的遺傳學(xué)效應(yīng)1、轉(zhuǎn)座引入插入突變2、轉(zhuǎn)座產(chǎn)生新的基因3、轉(zhuǎn)座產(chǎn)生的染色體畸變4、轉(zhuǎn)座引起生物進(jìn)化轉(zhuǎn)座子分為轉(zhuǎn)座子分為插入序列和復(fù)合型轉(zhuǎn)座子兩大類環(huán)狀環(huán)狀DNA復(fù)制方式復(fù)制方式Θ型、滾環(huán)型和D環(huán)型第三章第三章生物信息的傳遞（上）生物信息的傳遞（上）從DNA到RNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄指拷貝出一條與DNA鏈序列完全相同的RNA單鏈的過程啟動子啟動子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5′段上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確地結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性原核生物啟動子結(jié)構(gòu)原核生物啟動子結(jié)構(gòu)存在位于10BP處的TATA區(qū)和35BP處的TTGACA區(qū)，其是RNA聚合酶與啟動子的結(jié)合位點(diǎn)，能與Σ因子相互識別而具有很高的親和力終止子終止子是給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的DNA序列（促進(jìn)轉(zhuǎn)錄終止的DNA序列）終止子的類型終止子的類型不依賴于Ρ因子和依賴于Ρ因子增強(qiáng)子增強(qiáng)子能增強(qiáng)或促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始的序列增強(qiáng)子的特點(diǎn)增強(qiáng)子的特點(diǎn)1、遠(yuǎn)距離效應(yīng)2、無方向性3、順式調(diào)節(jié)4、無物種和基因的特異性5、具3SRP與SRP受體相結(jié)合，核糖體與膜結(jié)合，翻譯重新開始4信號肽進(jìn)入膜結(jié)構(gòu)5蛋白質(zhì)過膜，信號肽被切除，翻譯繼續(xù)進(jìn)行6蛋白質(zhì)完全過膜，核糖體解離第五章第五章SNP是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸的突變而引起的多肽性。RACE技術(shù)技術(shù)是一項(xiàng)在已知CDNA序列的基礎(chǔ)上克隆5′端或3′端缺失序列的技術(shù)，在很大程度上依賴于RNA連接酶連接和寡聚帽子的快速擴(kuò)增核酸凝膠電泳技術(shù)原理核酸凝膠電泳技術(shù)原理PCR原理原理首先將雙鏈DNA分子在臨近沸點(diǎn)的溫度下加熱分離成兩條單鏈DNA分子，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應(yīng)混合物中的四種脫氧核苷三磷酸合成新生的DNA互補(bǔ)鏈?；蚪M文庫基因組文庫把某種生物的基因組DNA切成適當(dāng)大小，分別與載體組合，導(dǎo)入微生物細(xì)胞，形成克隆。這些存在于所有重組體內(nèi)的基因組DNA片段集合即基因組DNA文庫。CDNA文庫文庫以組織細(xì)胞中MRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成的雙鏈CDNA。第七章第七章基因表達(dá)基因表達(dá)從DNA到蛋白質(zhì)或功能RNA的過程稱為基因表達(dá)?；虮磉_(dá)調(diào)控基因表達(dá)調(diào)控對從DNA到蛋白質(zhì)或功能RNA的過程的調(diào)節(jié)就稱為基因表達(dá)調(diào)控。乳糖操縱子模型的主要內(nèi)容乳糖操縱子模型的主要內(nèi)容1Z，Y，A基因的產(chǎn)物是由同一條多順反子的MRNA分子所編碼的。2該MRNA分子的啟動區(qū)（P）為于遏制基因（I）與操縱區(qū)（O）之間，不能單獨(dú)起始半乳糖苷酶和透過酶基因的高效表達(dá)。3操縱區(qū)是DNA上的一小段序列，是遏制物的結(jié)合位點(diǎn)。4當(dāng)阻遏物與操縱區(qū)相結(jié)合時，LACMRNA的轉(zhuǎn)錄起始受到抑制。5誘導(dǎo)物通過與阻遏物結(jié)合，改變它的三維構(gòu)象，使之不能與操縱區(qū)相結(jié)合，從而激發(fā)LACMRNA的合成。色氨酸操縱子色氨酸操縱子（TRP操縱子）色氨酸合成分五步完成，有七個基因參與整個合成過程，TRPE和TRPG編碼鄰氨基苯甲酸合酶，TRPD編碼鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，TRPF編碼異構(gòu)酶，TRPC編碼吲哚甘油磷酸合酶，TRPA和TRPB則分別編碼色氨酸合酶的Α和Β亞基，在許多細(xì)菌中，TRPE和TRPG融合成一個功能基因，TRPC和TRPB也融合成一個基因，產(chǎn)生具有雙重功能的蛋白質(zhì)，TRPE基因是第一個被翻譯的基因，和TRPE緊鄰的是啟動子區(qū)和操縱區(qū)第八章第八章基因家族基因家族真核細(xì)胞中許多相關(guān)的基因常按功能成套組合，被稱為基因家族。簡述真核細(xì)胞與原核細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)錄，翻譯及簡述真核細(xì)胞與原核細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)錄，翻譯及DNA的空間結(jié)構(gòu)方面存在的差異的空間結(jié)構(gòu)方面存在的差異一、基因轉(zhuǎn)錄1、原核生物的RNA聚合酶是一種多聚體蛋白質(zhì)真核生物的RNA聚合酶有三種（RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），分別轉(zhuǎn)錄不同種類的RNA2、原核生物轉(zhuǎn)錄全過程均需RNA聚合酶催化，起始過程需核心酶，由Σ亞基辨認(rèn)起始點(diǎn)，被辨認(rèn)的DNA區(qū)段是35區(qū)，延長過程的核苷酸聚合僅需核心酶催化，終止分依賴Ρ因子的和不依賴Ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止；真核生物轉(zhuǎn)錄過程轉(zhuǎn)錄起始前的25BP區(qū)段多有典型的TATA序列，稱為TATABOX，通常認(rèn)為這就是啟動子的核心序列。此外DNA分子上還具有

簡介：協(xié)和醫(yī)科大學(xué)2006年生物化學(xué)與分子生物學(xué)（專業(yè)）（博士）一、填空（24空24分）1年，由和（英文姓）首次提出了DNA的雙螺旋模型，其結(jié)果發(fā)表在雜志，他們提出的實(shí)驗(yàn)依據(jù)是和。2蛋白質(zhì)濃度測定在NM原因是但有時候也在220NM處測量，原因是3表皮生長因子受體具有酶的活性，4嗅覺、視覺、味覺和細(xì)胞膜上的蛋白結(jié)合，這種受體具有的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，產(chǎn)生的第二信使是二、名詞解釋（4題16分）1CPGISL2CTDOFRNAPOLII3SIRNA4BASICLEUCRINEZIP5SIRNA6BASICLEUZIGZAG堿性亮氨酸拉鏈三、問答題（4題40分）1基因組DNA有時會產(chǎn)生GT錯配，DNA復(fù)制時有時會發(fā)生AC錯配，他們產(chǎn)生的原因是什么，各怎么修復(fù)（12分）2大腸桿菌的啟動子（或操縱子）活性有無強(qiáng)弱之分，如果有，決定其強(qiáng)弱的因素什么（10分）3什么是基因印記（IMPRINTING）它是怎么遺傳的舉例說明。（10分）4為什么說‘RIBOSOMEISARIBOZYME”（8分）四，名詞解釋4題8分1酵母雙雜交2細(xì)菌人工染色體過時，請談一下你對此觀點(diǎn)的看法協(xié)和醫(yī)科大學(xué)2005年生物化學(xué)與分子生物學(xué)（?；ú┦浚┮?、名詞1、必需脂肪酸2、磷氧比3、糖異生4、酮體二、判斷請判斷對錯后并改錯。1有氧條件改為無氧條件，葡萄糖的利用速度增加2氰化物阻止了氧化磷酸化3非糖飲食，偶數(shù)脂肪酸比奇數(shù)脂肪酸好4膽固醇增高癥患者，服用谷固醇，會增高血脂之類的三、填空1糖原合成的關(guān)鍵酶是___，糖原分解的限素酶是___。2乙酰輔酶A的來源有4個________，去向4個________。3血液中的氨的來源4氨基丁酸的前體是__5蛋白在280NM處吸收強(qiáng)的原因是有___，___，___。6膽固醇的代謝終產(chǎn)物是__7脂肪酸進(jìn)入MT的載體是__四、簡答題膽汁酸腸肝循環(huán)和意義五、填空題1體內(nèi)合成1摩尿素消耗___個ATP可以過膜運(yùn)輸?shù)闹虚g物是___和___，___水解后生成尿素。2非蛋白N是__3腦的氨的轉(zhuǎn)運(yùn)形式是__4連接尿素和TCA循環(huán)的中間物為____5CPS是__和__的中間產(chǎn)物6___脫羧成為使血管擴(kuò)張的物質(zhì)7__氨基酸參與嘧啶合成8蛋白質(zhì)組學(xué)是____________________________________的學(xué)科六、論述題1根據(jù)圖說明DNA鏈的方向，標(biāo)出核糖C的序號，并畫出另一條相應(yīng)的DNA鏈。圖的內(nèi)容是給了一個鏈沒有標(biāo)出方向2（已知DDCTP和DCTP的結(jié)構(gòu)式（就是一個少4位的OH，一個少5位的P）），問在DNA復(fù)制反應(yīng)中，

簡介：問答題1衰老與基因的結(jié)構(gòu)與功能的變化有關(guān)，涉及到衰老與基因的結(jié)構(gòu)與功能的變化有關(guān)，涉及到（1）生長停滯；（2）端?？s短現(xiàn)象；（3）DNA損傷的累積與修復(fù)能力減退；（4）基因調(diào)控能力減退。2超螺旋的生物學(xué)意義超螺旋的生物學(xué)意義（1）超螺旋的DNA比松馳型DNA更緊密，使DNA分子體積變得更小，對其在細(xì)胞的包裝過程更為有利；（2）超螺旋能影響雙螺旋的解鏈程序，因而影響DNA分子與其它分子（如酶、蛋白質(zhì)）之間的相互作用。3原核與真核生物學(xué)原核與真核生物學(xué)MRNA的區(qū)別的區(qū)別原核（1）往往是多順反子的，即每分子MRNA帶有幾種蛋白質(zhì)的遺傳信息（來自幾個結(jié)構(gòu)基因）。（2）5端無帽子結(jié)構(gòu)，3端一般無多聚A尾巴。（3）一般沒有修飾堿基，即這類MRNA分子鏈完全不被修飾。真核（1）5端有帽子結(jié)構(gòu)（2）3端絕大多數(shù)均帶有多聚腺苷酸尾巴，其長度為20200個腺苷酸。（3）分子中可能有修飾堿基，主要有甲基化，（4）分子中有編碼區(qū)與非編碼區(qū)。4TRNA的共同特征的共同特征（）單鏈小分子，含7393個核苷酸。（2）含有很多稀有堿基或修飾堿基。（3）5端總是磷酸化，5末端核苷酸往往是PG。（4）3端是CPCPAOH序列。（5）分子中約半數(shù)的堿基通過鏈內(nèi)堿基配對互相結(jié)合，開成雙螺旋，從而構(gòu)成其二級結(jié)構(gòu)，開頭類似三葉草。（6）三級結(jié)構(gòu)是倒L型。5核酶分類核酶分類（1）異體催化的剪切型，如RNASEP；（2）自體催化的剪切型，如植物類病毒等；（3）內(nèi)含子的自我剪接型，如四膜蟲大核26SRRNA前體。6HNRNA變成有活性的成熟的變成有活性的成熟的MRNA的加工過程的加工過程（1）5端加帽；（2）3端加尾（3）內(nèi)含子的切除和外顯子的拼接；（4）分子內(nèi)部的甲基化修飾作用，（5）核苷酸序列的編輯作用。7反義反義RNA及其功能及其功能堿基序列正好與有意義MRNA互補(bǔ)的RNA稱為反意義或反義RNA，又稱調(diào)節(jié)RNA，這類RNA是單鏈RNA，可與MRNA配對結(jié)合形成雙鏈，最終抑制MRNA作為模板進(jìn)行翻譯。這是其主要調(diào)控功能，還可作為DNA復(fù)制的抑制因子，與引物RNA互補(bǔ)結(jié)合抑制DNA的復(fù)制，以及在轉(zhuǎn)錄水平上與MRNA5末端互補(bǔ)，阻止RNA合成轉(zhuǎn)錄。8病毒基因組分型病毒基因組分型（1）雙鏈DNA（2）單鏈正股DNA（3）雙鏈RNA（4）單鏈負(fù)股RNA（5）單鏈正股RNA9病毒基因組結(jié)構(gòu)與功能的特點(diǎn)病毒基因組結(jié)構(gòu)與功能的特點(diǎn)（1）不同病毒基因組大小相差較大；（2）不同病毒的基因組可以是不同結(jié)構(gòu)的核酸。（3）病毒基因組有連續(xù)的也有不連續(xù)的；（4）病毒基因組的編碼序列大于90；（5）單倍體基因組，（6）基因有連續(xù)的和間斷的，（7）相關(guān)基因叢集；（8）基因重疊（9）病毒基因組含有不規(guī)則結(jié)構(gòu)基因，主要類型有A幾個結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)無間隔；BMRNA沒有5端的帽結(jié)構(gòu)；C結(jié)構(gòu)基因本身沒有翻譯起始序列。10原核生物基因組的結(jié)構(gòu)的功能特點(diǎn)原核生物基因組的結(jié)構(gòu)的功能特點(diǎn)（1）基因組通常僅由一條環(huán)狀雙鏈DNA分子組成。（2）基因組中只有1個復(fù)制起點(diǎn)。（3）具有操縱子結(jié)構(gòu)。（4）編碼順序一般不會重疊。（5）基因是連續(xù)的，無內(nèi)含子，因此轉(zhuǎn)錄后不需要剪切。（6）編碼區(qū)在基因組中所占的比例（約占50）遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于真核基因組，但又遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于病毒基因組。（7）基因組中重復(fù)序列很少（8）具有編碼同工酶的基因。（9）細(xì)菌基因組中存在著可移動的DNA序列，包括插入序列和轉(zhuǎn)座子。（10）在DNA分子中具有多種功能的識別區(qū)域。11真核生物基因組結(jié)構(gòu)與功能的特點(diǎn)真核生物基因組結(jié)構(gòu)與功能的特點(diǎn)（1）每一種真核生物都有一定的染色體數(shù)目，除了配子為單倍體外，體細(xì)胞一般為雙倍體。（2）真核基因組遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原核生物的基因組，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，基因數(shù)龐大。（3）都由一個結(jié)構(gòu)基因與相關(guān)的調(diào)控區(qū)組成，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子。（4）含有大量重復(fù)順序。（5）基因組內(nèi)非編碼的順序占90以上。（6）真核基因是斷裂基因，（7）功能相關(guān)的基因構(gòu)成各種基因家族，它們可串聯(lián)在一起，亦可相距很遠(yuǎn)，但即使串聯(lián)在一起的成簇的基因也是分別轉(zhuǎn)錄的。（8）真核生物基因組中也存在一些可移動的遺傳因素，這些DNA順序并無明顯生物學(xué)功能，似乎為自己的目的而組織，故有自私DNA之稱。12根據(jù)同源性程度，主要分五種類型根據(jù)同源性程度，主要分五種類型（1）核酸序列相同，實(shí)際上是多拷貝基因；（2）核酸序列高度同源，如人類生長激素基因家族；（3）編碼產(chǎn)物具有同源功能區(qū)；（4）編碼產(chǎn)物具有小段保守基序；（5）基因超家族。13DNA復(fù)制的基本過程復(fù)制的基本過程（1）DNA雙鏈解開；（2）RNA引物的合成；（3）DNA鏈的延長；（4）切除引物、填補(bǔ)缺口、連接相鄰DNA片段；（5）切除和修復(fù)錯配堿基。14DＮＡ的損傷方式ＮＡ的損傷方式（１）轉(zhuǎn)換由一種嘧啶變成另一種嘧啶，或種嘌呤變成另一種嘌呤；（２）顛換嘧呤與嘌呤互換。轉(zhuǎn)換和顛換只引起ＤＮＡ局部的改變，而ＤＮＡ其它部分的結(jié)構(gòu)不受影響，故稱為點(diǎn)突變。（３）丟失或插當(dāng)物理或化學(xué)信號刺激受體時，受體活化，與G蛋白結(jié)合并使之發(fā)生構(gòu)象改變。A亞基與GDP的親和力下降，結(jié)合的GDP為GTP所取代。A亞基結(jié)合了GTP后即與BR亞基發(fā)生解離，成為活化狀態(tài)的A亞基?；罨说腁亞基此時可以作用于下游的各種效應(yīng)分子。這種活化狀態(tài)將一直持續(xù)到GTP被A亞基自身具有的GTP酶水解為GDP。33小分子細(xì)胞內(nèi)信使一般具有的三個特點(diǎn)小分子細(xì)胞內(nèi)信使一般具有的三個特點(diǎn)（1）不位于能量代謝途徑的中心；（2）在細(xì)胞中的濃度或分布可以迅速地改變；（3）作為變構(gòu)效應(yīng)劑作用于相應(yīng)的靶分子，已知的靶分子主要為各種蛋白激酶。34表皮生長因子受體（表皮生長因子受體（EGFR）介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑）介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑EGFRRASMAPK（1）受體二聚體的形成及其磷酸化；（2）募集接頭蛋白GRB2（3）調(diào)控分子SOS的活化（4）低分子量G蛋白RAS的活化；（5）MAPK的級聯(lián)激活；（6）轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。35R干擾素受體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑干擾素受體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑R干擾素與受體結(jié)合以后。也可以導(dǎo)致受體二聚體化，二聚體化的體可以激活JALSTAT系統(tǒng)，后者將干擾素刺激信號傳入核內(nèi)。JAK為一種存在于胞漿中的蛋白酪氨酸激酶，它活化后可使干擾素受體磷酸化。STAT可以通過其SH2結(jié)構(gòu)域識別磷酸化的受體并與之結(jié)合，然后STAT分子亦發(fā)生酪氨酸的磷酸化，酪氨酸磷酸化的STAT形成二聚體并進(jìn)入胞核。二聚體STAT分子作為有活性的轉(zhuǎn)錄因子，影響相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而改變靶細(xì)胞的增殖與分化。36KLENOW片段的用途片段的用途（1）補(bǔ)齊雙鏈DNA的3末端；（2）通過補(bǔ)齊3端使3末端標(biāo)記；（3）在CDNA克隆中，第二股鏈的合成。（4）DNA序列分析。37幾種常見修飾酶幾種常見修飾酶（1）DNA聚合酶I這個酶除有聚合酶活性外，尚有35及53核酸外切酶活性。由于它具有53核酸外切酶活性，當(dāng)用缺口平移法標(biāo)記DNA探針時，常用DNA聚合酶I。（2）逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成DAN，合成時需要4種脫氧核苷酸及引物，合成方向?yàn)?3延伸，無35外切酶活性。廣泛用于MRNA為模板合成CDNA，構(gòu)建CDNA文庫。（3）T4DNA連接酶催化雙鏈DNA一端3OH與另一雙鏈DNA的5端磷酸根形成3、5磷酸二酯鍵，使具有相同粘性末端或平端的DNA末端連接起來。（4）堿性磷酸酶去除DNA或RNA5端的磷酸根，制備載體時，用堿性磷酸酶處理后，可防止載體自身連接，提高重組效率。（5）末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TDT）將脫氧核苷酸加到DNA的3OH上，主要用于探針標(biāo)記；或者在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于進(jìn)行連接。（6）TAQDNA聚合酶和其它耐熱DNA聚合酶。38作為克隆載體的質(zhì)粒具備以下特點(diǎn)作為克隆載體的質(zhì)粒具備以下特點(diǎn)（1）分子量相對較小，能在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定存在，有較高的拷貝數(shù)。（2）具有一個以上的遺傳標(biāo)志，便于對宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇，（3）具有多個限制酶的單一切點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)（MCS）。3939粘性質(zhì)粒的特點(diǎn)粘性質(zhì)粒的特點(diǎn)（1）含有質(zhì)粒的抗藥性標(biāo)記（2）帶有入噬菌體的粘性末端（COS區(qū)）；（3）具有一個或多個限制酶的酶切位點(diǎn)；（4）其本身分子量小，容納40KB左右的DNA片段；（5）由于非重組粘性質(zhì)粒很小，不能在體外包裝，因而體外包裝的主要是重組體，有利于以后的篩選。4040M31M31噬菌體的優(yōu)點(diǎn)噬菌體的優(yōu)點(diǎn)（1）噬菌體顆粒中所含有的是單鏈DNA，該單鏈DNA可作為模板用于DNA序列分析；（2）利用單鏈M13克隆可制備成單鏈DNA探針用于雜交分析，檢測DNA或RNA，或者作為基因定點(diǎn)誘變的載體。4141大腸桿菌與哺乳動物表達(dá)載體的不同大腸桿菌與哺乳動物表達(dá)載體的不同大腸桿菌含有復(fù)制位點(diǎn)、抗性基因、克隆位點(diǎn)，可導(dǎo)入大腸桿菌，與克隆載體一樣，表達(dá)載體中含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動子核糖體結(jié)合位點(diǎn)克隆位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止信號。哺乳動物真核表達(dá)載體中含有一套真核表達(dá)元件；啟動子增強(qiáng)子克隆位點(diǎn)終止信號和加POLYA信號。4242重組重組DNADNA的目的和基本過程的目的和基本過程目的（1）克隆某個特定的基因；（2）建立基因文庫、CDNA文庫，（3）將特定的基因片段進(jìn)行亞克隆以進(jìn)行DNA序列測定；（4）構(gòu)建表達(dá)載體以便在特定的宿主細(xì)胞中表達(dá)某個基因。過程（1）制備目的基因和相關(guān)載體（2）將目的基因和有關(guān)載體進(jìn)行連接（3）將重組的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞（4）DNA重組體的篩選和鑒定（5）DNA重組體的擴(kuò)增、表達(dá)和其它研究。4343CＤＮＡ的合成過程ＤＮＡ的合成過程先從細(xì)胞中提取高質(zhì)量的MＲＮＡ。因MＲＮA有POLYA尾巴，可用1218寡聚DT片段作為引物，加入4種DNTPAMV或MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶催化第一股鏈的合成。然后用RNASEH去掉MRNA，剩下的單鏈DNA的3端往往有自發(fā)回折（原因不明）形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，正好可以作為合成第二條DNA鏈的引物；由T4DNA聚合酶催化

簡介：1分子生物學(xué)1DNA的一級結(jié)構(gòu)指DNA分子中核苷酸的排列順序。2DNA的二級結(jié)構(gòu)指兩條DNA單鏈形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)、三股螺旋結(jié)構(gòu)以及四股螺旋結(jié)構(gòu)。3DNA的三級結(jié)構(gòu)雙鏈DNA進(jìn)一步扭曲盤旋形成的超螺旋結(jié)構(gòu)。4DNA的甲基化DNA的一級結(jié)構(gòu)中，有一些堿基可以通過加上一個甲基而被修飾，稱為DNA的甲基化。甲基化修飾在原核生物DNA中多為對一些酶切位點(diǎn)的修飾，其作用是對自身DNA產(chǎn)生保護(hù)作用。真核生物中的DNA甲基化則在基因表達(dá)調(diào)控中有重要作用。真核生物DNA中，幾乎所有的甲基化都發(fā)生于二核苷酸序列5’CG3’的C上，即5’MCG3’5CG島基因組DNA中大部分CG二核苷酸是高度甲基化的但有些成簇的、穩(wěn)定的非甲基化的CG小片段稱為CG島存在于整個基因組中?！癈G”島特點(diǎn)是GC含量高以及大部分CG二核苷酸缺乏甲基化。6DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（1）DNA是反向平行的互補(bǔ)雙鏈結(jié)構(gòu)。（2）DNA雙鏈?zhǔn)怯沂致菪Y(jié)構(gòu)。螺旋每旋轉(zhuǎn)一周包含了10對堿基，螺距為34NMDNA雙鏈說形成的螺旋直徑為2NM。每個堿基旋轉(zhuǎn)角度為36度。DNA雙螺旋分子表面存在一個大溝和一個小溝，目前認(rèn)為這些溝狀結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)和DNA間的識別有關(guān)。（3）疏水力和氫鍵維系DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定橫向依靠兩條鏈互補(bǔ)堿基間的氫鍵維系，縱向則靠堿基平面間的疏水性堆積力維持。7核小體的組成染色質(zhì)的基本組成單位被稱為核小體，由DNA和5種組蛋白H1H2AH2BH3和H4共同構(gòu)成。各兩分子的H2AH2BH3和H4共同構(gòu)成八聚體的核心組蛋白，DNA雙螺旋纏繞在這一核心上形成核小體的核心顆粒。核小體的核心顆粒之間再由DNA和組蛋白H1構(gòu)成的連接區(qū)連接起來形成串珠樣結(jié)構(gòu)。8順反子（CISTRON）由結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄生成的RNA序列亦稱為順反子。9單順反子（MONOCISTRON）真核生物的一個結(jié)構(gòu)基因與相應(yīng)的調(diào)控區(qū)組成一個完整的基因，即一個表達(dá)單位，轉(zhuǎn)錄物為一個單順反子。從一條MRNA只能翻譯出一條多肽鏈。10多順反子POLYCISTRON原核生物具有操縱子結(jié)構(gòu)，幾個結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄在一條MRNA鏈上，因而轉(zhuǎn)錄物為多順反子。每個順反子分別翻譯出各自的蛋白質(zhì)。11原核生物MRNA結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)1原核生物MRNA往往是多順反子的，即每分子MRNA帶有幾種蛋白質(zhì)的遺傳信息。（2）MRNA5‘端無帽子結(jié)構(gòu)，3‘端無多聚A尾。（3）MRNA一般沒有修飾堿基。12真核生物MRNA結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)（1）5‘端有帽子結(jié)構(gòu)。即7－甲基鳥嘌呤－三磷酸鳥苷M7GPPPN。（2）3‘端大多數(shù)帶有多聚腺苷酸尾巴。（3）分子中可能有修飾堿基，主要有甲基化。（4）分子中有編碼區(qū)和非編碼區(qū)。14TRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（1）TRNA是單鏈小分子。（2）TRNA含有很多稀有堿基。328操縱子（OPERON）是指數(shù)個功能上相關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起，構(gòu)成信息區(qū)，連同其上游的調(diào)控區(qū)（包括啟動子和操縱序列）和下游的轉(zhuǎn)錄終止信號所構(gòu)成的基因表達(dá)單位，所轉(zhuǎn)錄的RNA為多順反子。29質(zhì)粒是存在于細(xì)菌染色體之外的、具有自主復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。30質(zhì)粒的不相容性具有相同復(fù)制起始位點(diǎn)和分配區(qū)的兩種質(zhì)粒不能共存于一個宿主菌，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性。31轉(zhuǎn)座因子既可移動的基因成分，是指能在一個DNA分子內(nèi)部或兩個DNA分子之間移動的DNA片段。原核生物的轉(zhuǎn)座因子包括插入序列、轉(zhuǎn)座子和MU噬菌體。32插入序列是一類較小的沒有表型效應(yīng)的轉(zhuǎn)座因子，由一個轉(zhuǎn)位酶基因及兩側(cè)的反向重復(fù)序列組成。33轉(zhuǎn)座子是一類較大的可移動成分，除有關(guān)轉(zhuǎn)座的基因外，至少帶有一個與轉(zhuǎn)座作用無關(guān)的并決定宿主菌遺傳性狀的基因。34斷裂基因真核生物的結(jié)構(gòu)基因，由若干個編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔而又連續(xù)鑲嵌而成，去除編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)這些基因稱為斷裂基因。35SNRNA核內(nèi)小RNA，分子中尿嘧啶含量最豐富。SNRNA和核內(nèi)蛋白質(zhì)組成小分子核糖核蛋白體，作為RNA剪接的場所。36啟動子能夠被RNA聚合酶識別并結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。典型的啟動子包括TATA盒，CAAT盒和GC盒。37反應(yīng)元件一些信息分子的受體被細(xì)胞外信息分子激活后，能與特異的DNA序列結(jié)合，調(diào)控基因的表達(dá)。這些特異的DNA序列實(shí)際上也是順式元件，由于能介導(dǎo)基因?qū)?xì)胞外的某種信號產(chǎn)生反應(yīng)，被稱為反應(yīng)元件。38基因家族指核苷酸序列或編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)具有一定程度同源性的一組基因。39端粒DNA重復(fù)序列TTAGGG。微衛(wèi)星DNA常見重復(fù)單位AC和（TG）。40衛(wèi)星DNA是出現(xiàn)在非編碼區(qū)的串聯(lián)重復(fù)序列。其特點(diǎn)是具有固定的重復(fù)序列，該重復(fù)單位首尾相連形成重復(fù)序列片段，通常存在于間隔DNA和內(nèi)含子中。衛(wèi)星DNA可分為大衛(wèi)星DNA、小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA。41端粒以線性染色體形式存在的真核基因組DNA的末端都有一種特殊的結(jié)構(gòu)，端粒。該結(jié)構(gòu)是一段DNA序列和蛋白質(zhì)形成的一種復(fù)合體，僅在真核細(xì)胞染色體末端存在。端粒的功能主要有保護(hù)線性DNA的完整復(fù)制，保護(hù)染色體末端及決定細(xì)胞的壽命等。42ALU家族序列中有限制性內(nèi)切酶ALU的酶切位點(diǎn)。重復(fù)單位是300BP屬短散在核元件，為靈長類基因組所特有。43假基因是指與某些有功能的基因結(jié)構(gòu)相似，但不能表達(dá)基因產(chǎn)物的基因。44人類基因組的四張圖譜遺傳圖、物理圖、序列圖和轉(zhuǎn)錄圖。遺傳圖指基因或DNA標(biāo)記在染色體上以遺傳距離表示的相對位置。物理圖指基因或DNA標(biāo)記間的實(shí)際距離。序列圖指人類基因組的全部核苷酸序列，也是最詳盡的物理圖。轉(zhuǎn)錄圖指基因圖譜。45端粒酶由三部分組成，端粒RNA，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶，端粒酶協(xié)同蛋白。端粒酶兼有提供RNA模版和催化逆轉(zhuǎn)錄酶的功能。端粒酶通過一種爬行模型的機(jī)制維持染色體的完整。46半保留復(fù)制子代細(xì)胞的DNA，一股單鏈從親代完整的接受過來，另一股單鏈則完全重新合成，兩個子細(xì)胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致，這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。47半不連續(xù)復(fù)制順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈。另一股鏈因?yàn)閺?fù)制方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，必須等模板鏈解

簡介：第19章分子生物學(xué)常用技術(shù)－－4學(xué)時分子雜交、PCR、基因測序蛋白質(zhì)研究技術(shù)雙向電泳，酵母雙雜交基因轉(zhuǎn)移與基因剔除含RNA干擾第20章基因工程－－4學(xué)時第21章基因診斷與基因治療－－4學(xué)時,第四篇分子生物學(xué)技術(shù)與應(yīng)用,,第十九章,分子生物學(xué)常用技術(shù),分子生物學(xué)技術(shù)能幫助我們干什么,揭示生物大分子DNA、RNA、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能DNA水平基因序列分析、拷貝數(shù)和染色體定位RNA水平定量分析、基因表達(dá)產(chǎn)物的可變剪接分析蛋白質(zhì)水平蛋白質(zhì)定量、定位、功能細(xì)胞與整體水平基因在活體中的功能目的了解疾病發(fā)生的規(guī)律，提供治療與預(yù)防手段,我們需要了解和掌握哪些基本技術(shù),基本技術(shù)核酸測序、印跡、雜交、體外擴(kuò)增技術(shù)蛋白質(zhì)電泳與印跡、組學(xué)技術(shù)、相互作用綜合技術(shù)基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)基因生物與基因敲除技術(shù)應(yīng)用技術(shù)基因診斷基因治療,MOLECULARHYBRIDIZATION利用已知核酸序列探針/PROBE檢測與其互補(bǔ)的未知核酸序列用途確認(rèn)核酸序列間同源性對特定核酸序列進(jìn)行定量自核酸混合體中辨認(rèn)特定核酸序列,第一節(jié)核酸分子雜交,一、基本原理,變性DENATURE復(fù)性RENATURE雜交HYBIRIDIZATION,,,核酸變性,在特定變性因素作用下，DNA雙螺旋解離的過程破壞氫鍵與疏水作用可導(dǎo)致變性熱變性高溫可使核酸變性，溫度高于90℃時任何核酸雙鏈都將變性酸堿變性PH11時核酸將變性，DNA使用堿變性，RNA則不可化學(xué)試劑變性能夠破壞氫鍵的化學(xué)試劑如尿素或甲酰胺可使核酸變性,變性溫度,TMMELTINGTEMPERATURE，解鏈溫度或變性溫度影響變性溫度的因素溶液的離子強(qiáng)度變性溫度與離子強(qiáng)度正相關(guān)，低鹽利于變性DNA分子的GC含量GC％＝TM－693224,核酸復(fù)性,變性的DNA單鏈相互識別并結(jié)合，恢復(fù)其天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程復(fù)性類似與化學(xué)反應(yīng)，需要一定反應(yīng)時間,影響DNA復(fù)性速度的因素,DNA分子的濃度濃度高，復(fù)性快DNA分子的長度長片段復(fù)性速度慢DNA分子的復(fù)雜性重復(fù)序列復(fù)性速度快不同物種C0T曲線比較人類基因組C0T曲線,二、核酸探針,PROBE用于測定未知核酸片段的已知序列探針為DNA或RNA，可以為單鏈或雙鏈探針必需經(jīng)過標(biāo)記放射性標(biāo)記或非放射性標(biāo)記,1探針有哪些種類,DNA探針常規(guī)探針利用基因組DNA序列或CDNA序列合成的探針，一般為雙鏈，也可制備成單鏈RNA探針高靈敏度探針一般是通過體外轉(zhuǎn)錄而來，均為單鏈寡核苷酸探針OLIGONUCLEOTIDE用于點(diǎn)突變檢測人工合成的短序列20NT，可自由選擇序列,2標(biāo)記物有哪些,標(biāo)記物的要求高度的靈敏性足以檢測到極微量的核酸序列高度的特異性足以在大量非特異性序列中檢測到特異的靶序列標(biāo)記物的種類放射性同位素RADIOISOTOPE非放射性標(biāo)記物NONRADIOACTIVELABEL,放射性同位素,特點(diǎn)靈敏度最高的標(biāo)記物，足以檢測到飛克級微量的核酸序列G→MG→ΜG→NG→PG→FG常用的放射性同位素,放射性標(biāo)記的核苷酸單體,DNTPORNTP5’OR3’P32LABELLING,非放射性標(biāo)記物,特點(diǎn)安全且易于存放，但靈敏度與特異性均不及放射性同位素地高辛通過地高辛抗體結(jié)合并檢測生物素結(jié)合親和素/鏈親和素AVIDIN/STREPTAVIDIN化學(xué)發(fā)光物質(zhì)通過紫外激發(fā)或化學(xué)反應(yīng)而發(fā)光電子密度標(biāo)記物金等重金屬,3如何檢測雜交信號,同位素標(biāo)記物蓋革計(jì)數(shù)器、液體閃爍計(jì)數(shù)器放射自顯影AUTORADIOGRAPHY,如何檢測雜交信號,非放射性標(biāo)記物酶聯(lián)免疫技術(shù)ENZYMELINKEDIMMUNOASSAY化學(xué)發(fā)光CHEMILUMINESCENCE,三、如何對核酸探針進(jìn)行標(biāo)記,1缺口平移,NICKTRANSLATION適用于標(biāo)記雙鏈DNA控制DNASEI的用量，可以控制探針的長度,2非放探針的酶促標(biāo)記,生物素或地高辛標(biāo)記的核苷酸單體通過酶促反應(yīng)可以參入探針,3非放探針的化學(xué)標(biāo)記,利用光敏基因經(jīng)可見光照射直接與核酸結(jié)合,四、如何進(jìn)行雜交,樣品DNAORRNA吸附于支持物尼龍膜、硝酸纖維膜、載玻片等與標(biāo)記的探針雜交封閉液封閉后雜交，雜交爐中進(jìn)行緩沖液清洗控制溫度與變性劑濃度顯色放射自顯影/酶聯(lián)顯色,五、雜交有哪些不同的方式,斑點(diǎn)雜交DOTHYBRIDIZATIONSOUTHERN印跡雜交SOUTHERNBLOTNORTHERN印跡雜交NORTHERNBLOTWESTERNBLOTTING不是雜交原位雜交INSITUHYBRIDIZATION反NORTHERN印跡雜交REVERSENORTHERNBLOT基因芯片/DNA微陣列GENECHIP/DNAMICROARRAY,DOTHYBRIDIZATION,將核酸樣品直接點(diǎn)在雜交膜上與探針進(jìn)行雜交特點(diǎn)簡便但特異性不高可探測核酸含量，但無法得知分子大小,SOUTHERNBLOT,EDWINSOUTHERN創(chuàng)立的方法電泳技術(shù)與雜交結(jié)合，可顯示靶DNA序列的長度可進(jìn)行毛吸管轉(zhuǎn)移、真空轉(zhuǎn)移與電轉(zhuǎn)移,,,電泳,轉(zhuǎn)膜,雜交,NORTHERNBLOT,類似于SOUTHERN印跡雜交的方法，用于RNA檢測,INSITUHYBRIDIZATION,原位雜交特定MRNA的組織細(xì)胞分布,FISH,FLUORESCENCEINSITUHYBRIDIZATIONFISH特定基因的染色體定位,反NORTHERN雜交與DNA芯片,反NORTHERN雜交將探針DNA片段固定在雜交膜上，利用標(biāo)記物標(biāo)記的RNA進(jìn)行雜交,第二節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),PCR，POLYMERASECHAINREACTION在體外選擇性擴(kuò)增特定DNA片段的高效手段70年代有人提出PCR的設(shè)想，因缺乏寡核苷酸的合成手段和適合的酶而無法進(jìn)行1984年KARYMULLIS發(fā)明PCR，并因此獲得1993年的諾貝爾化學(xué)獎全自動的熱循環(huán)儀和多種PCR衍生技術(shù)使其成為重要的科學(xué)研究手段,一、PCR的基本原理,在體外，以特定引物引導(dǎo)，通過DNA聚合酶選擇性擴(kuò)增特定區(qū)域變性DENATURE退火ANNEAL延伸EXTENSION,DNA的體內(nèi)復(fù)制,引物酶,引物酶,DNA的體內(nèi)復(fù)制,DNA聚合酶,DNA聚合酶,DNA的體內(nèi)復(fù)制,DNA加熱解鏈,模板DNA,,,,引物1,引物2,引物1,引物2,TAQ酶,TAQ酶,第1輪結(jié)束,第2輪開始,72℃,,,,,,,,,,,,TAQ,TAQ,TAQ,,TAQ,55℃,,,,,,,,,,第2輪結(jié)束,模板DNA,第1輪擴(kuò)增,第2輪擴(kuò)增,第3輪擴(kuò)增,第4輪擴(kuò)增,第5輪擴(kuò)增,第6輪擴(kuò)增,理想拷貝數(shù)2NN循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)1XNX平均效率,約為085N循環(huán)次數(shù),,,,,,重復(fù)13步2530輪,目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上,DNA雙螺旋,DNA單鏈與引物復(fù)性,新鏈延伸,,,,,DNA的體外擴(kuò)增,熱循環(huán),DNA解鏈,,PCR反應(yīng)體系4種DNTP混合物各200ΜMOL/L引物各0105ΜMOL/L模板DNA01～2ΜGTAQDNA聚合酶25UMG215MMOL/L,DNA的體外擴(kuò)增,PCR技術(shù)的特點(diǎn),高度的靈敏性理論上經(jīng)20循環(huán)可將目的基因片段擴(kuò)增220＝1000000倍高度的特異性利用引物與模板的特異性配對，可保證擴(kuò)增的特異性一對20堿基長引物的多樣性為440＝1024應(yīng)用的廣泛性目前已經(jīng)成為分子生物學(xué)研究必不可少的手段操作的簡便性不需要復(fù)雜的設(shè)備和繁瑣的流程,二、做PCR要有什么條件,酶TAQDNA聚合酶模板DNA可以為基因組DNA或CDNA引物人工合成的寡核苷酸片段DNTP聚合反應(yīng)的核苷酸單體緩沖液包含特定的PH、離子強(qiáng)度和MG2反應(yīng)程序變性、退火、延伸組成的循環(huán)儀器DNA熱循環(huán)儀，或稱PCR儀,DNA聚合酶催化的聚合反應(yīng),,DNTP,1什么是耐熱DNA聚合酶,早期PCR曾使用DNA聚合酶I在高溫時發(fā)生變性，每一循環(huán)都需要重新添加酶延伸反應(yīng)溫度為37℃，非特異性太多目前常用TAQDNA聚合酶純化自嗜熱水生菌THERMUSAQUATICUS可耐受95℃高溫，最適反應(yīng)溫度為72℃左右,TAQDNAPOLYMERASE,在7075℃范圍活性最佳，每秒可延伸150NT95℃時的半衰期為40MIN按變性時間1MIN計(jì)，能滿足30循環(huán)的反應(yīng)TAQ酶具有5’→3’聚合活性和5’→3’外切活性不具備校讀活性，錯誤率為210－4左右錯誤合成的DNA片段可以作為模板，循環(huán)數(shù)越多，最終擴(kuò)增產(chǎn)物錯誤率越高只能用于檢測，不適合基因克隆,有保真性的耐熱DNA聚合酶嗎,PFUDNAPOLYMERASE常用的高保真耐熱DNA聚合酶有5’→3’外切活性錯誤率約110－6適應(yīng)于基因克隆,2如何設(shè)計(jì)寡聚核苷酸引物,引物PRIMER是PCR反應(yīng)必備的前提，對PCR產(chǎn)物類型、長度和反應(yīng)的特異性具有決定作用PCR需要兩條引物，引物決定擴(kuò)增范圍和擴(kuò)增片段長度,引物設(shè)計(jì)原則,引物長度一般為1530核苷酸引物太短影響雜交體的穩(wěn)定和特異性引物太長隨機(jī)匹配序列增多，特異性反而下降GC含量一般為40％60％應(yīng)充分考慮退火溫度ANNEALINGTEMPERATUREGC含量低，退火溫度低，易出現(xiàn)非特異GC含量高，非特異性結(jié)合也會增加引物解鏈溫度粗略計(jì)算公式引物的解鏈溫度TM＝4G＋C＋2A＋T,引物設(shè)計(jì)原則,引物自身不應(yīng)該存在鏈內(nèi)互補(bǔ)序列，以防止出現(xiàn)發(fā)卡結(jié)構(gòu),兩條引物間、同一引物的分子間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列出現(xiàn)互補(bǔ)易導(dǎo)致引物二聚體的出現(xiàn)，影響擴(kuò)增效率,引物設(shè)計(jì)原則,避免引物與非特異序列間的同源性引物的3，末端必須與模板完全互補(bǔ)，5，末端允許添加非配對序列5，末端允許添加非匹配序列，如酶切位點(diǎn),5’,3’,3如何選擇DNTP和緩沖液,DNTP是聚合反應(yīng)的底物常規(guī)使用濃度02MMEACH探針標(biāo)記時，可使用同位素或非放標(biāo)記的DNTP緩沖液特定的PH和離子強(qiáng)度MG2＋濃度一般為15MMPCRMIX預(yù)制的便捷反應(yīng)體系,4用什么做模板DNA,PCR的模板TEMPLATE可以是基因組DNA或CDNA逆轉(zhuǎn)錄PCRREVERSETRANSCRIPTIONPCRRTPCR在利用DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增時純化比較簡單血液、病原體、體外培養(yǎng)細(xì)胞、甚至病理標(biāo)本經(jīng)簡單處理后均可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增RNA樣品一般要經(jīng)過嚴(yán)格純化，并逆轉(zhuǎn)錄未經(jīng)純化的RNA不穩(wěn)定，無法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中如存在DNA，將對RNA擴(kuò)增產(chǎn)生干擾,6如何設(shè)計(jì)反應(yīng)程序,PCR的循環(huán)數(shù)理論上2025即可滿足擴(kuò)增需要，但實(shí)際循環(huán)數(shù)一般為2535過多循環(huán)后到達(dá)平臺期，繼續(xù)延長循環(huán)數(shù)無效,模板濃度高時平臺期出現(xiàn)早，模板濃度低時平臺期出現(xiàn)晚，應(yīng)根據(jù)模板濃度調(diào)節(jié)循環(huán)數(shù),反應(yīng)程序的關(guān)鍵是退火溫度,退火溫度提高退火溫度有助于提高反應(yīng)的特異性退火溫度過高將導(dǎo)致引物與模板無法配對，影響擴(kuò)增效率反應(yīng)的退火溫度主要取決于引物序列,三、我們能用PCR做什么,自PCR技術(shù)創(chuàng)立以來，經(jīng)近20年的發(fā)展，在基本PCR技術(shù)基礎(chǔ)上產(chǎn)生了多種PCR的衍生技術(shù)，應(yīng)用于各種不同的目的基因克隆或亞克?。蚬こ烫囟ɑ虮磉_(dá)量的分析基因突變的檢測－－基因診斷病原體特征性序列的鑒定－－基因診斷定點(diǎn)誘變－－第4節(jié)DNA序列測定－－第3節(jié),最常用的PCR是RTPCR,RTPCRREVERSETRANSCRIPTIONPCR以MRNA為模板先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行PCR為什么要以MRNA為模板MRNA無內(nèi)含子，克隆的基因可在原核表達(dá)MRNA的量代表了基因的表達(dá)水平,如何利用RTPCR檢測基因表達(dá)水平,定量PCRQUANTITATIVEPCRPCR產(chǎn)物的量與起始的模板量有關(guān)利用PCR對模板DNA或CDNA進(jìn)行定量測定定量PCR一般用于特定基因MRNA水平的檢測RTPCR可用于基因表達(dá)水平檢測需設(shè)定內(nèi)部參照物REFERENCEGENE，如GAPDH、ACTIN、18SRRNA等穩(wěn)定表達(dá)基因定量是相對的，一般是不準(zhǔn)確的,為什么說RTPCR定量是不準(zhǔn)確的,指數(shù)擴(kuò)增期，產(chǎn)物量與模板量成正比進(jìn)入平臺期，產(chǎn)物量不能再反應(yīng)模板量不同樣品進(jìn)入平臺期的循環(huán)數(shù)不同，難以選擇測定的時間節(jié)點(diǎn),有精確定量方法嗎,實(shí)時熒光定量PCRREALTIMEPCR以產(chǎn)物量到達(dá)一定閾值所需要的循環(huán)數(shù)為定量標(biāo)準(zhǔn)需要對PCR產(chǎn)物的生成量進(jìn)行動態(tài)監(jiān)控,,如何進(jìn)行產(chǎn)物量的實(shí)時檢測,需要熒光標(biāo)記探針與兩側(cè)PCR引物探針標(biāo)記有報(bào)告熒光與粹滅熒光反應(yīng)過程中探針被降解，報(bào)告熒光顯色可通過熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控,巢式PCR可以提高擴(kuò)增效率和特異性,NESTEDPRIMERPCR內(nèi)外兩套引物分兩輪進(jìn)行擴(kuò)增在克隆一些低豐度基因時可以采用,經(jīng)過兩輪PCR擴(kuò)增，具有更高的靈敏度四條引物均與模板匹配，因此增加了特異性,可以利用多對引物進(jìn)行多重PCR,多重PCRMULTIPRIMERPCR多組引物同時進(jìn)行的PCR，可大幅度降低PCR反應(yīng)的工作量,可以在組織切片上進(jìn)行原位PCR,原位PCRINSITUPCR在組織切片或細(xì)胞涂片上進(jìn)行的PCR方法主要用于特定基因表達(dá)水平的原位分析組織切片經(jīng)過固定、蛋白酶和DNASE消化后進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增,SEQUENCING基因結(jié)構(gòu)分析的最基本方法主要方式化學(xué)降解法酶法SANGER法/雙脫氧鏈末端終止法二代/三代測序技術(shù),第三節(jié)基因測序,適用于寡核苷酸片段測序的方法基本反應(yīng)GDMSG/A哌啶T/C肼低鹽C肼高鹽,一、化學(xué)降解法,SANGER在1977年建立的方法，也稱酶法測序DNA序列測定的最常用方法,二、雙脫氧末端終止法,在反應(yīng)體系中加入2’,3’DDNTP，由于其沒有3’OH而不能與下一個核苷酸相連，于是DNA鏈的合成便終止。,SANGER法測序,模板單鏈→單雙鏈均可酶KLENOW→耐熱DNA聚合酶標(biāo)記同位素標(biāo)記→熒光標(biāo)記電泳平板電泳→毛細(xì)管電泳4泳道→單一泳道,酶法測序的自動化程度越來越高,二代測序技術(shù)NEXTGENERATIONSEQUENCING1天完成全基因組測序羅氏、SOLEXA、ABI等公司各有不同技術(shù)利用微珠或芯片實(shí)現(xiàn)大通量，邊合成邊測序三代測序技術(shù)NEXTNEXTGENERATIONSEQUENCING3分鐘完成全基因組測序基于納米微孔的單分子測序技術(shù),二代測序與三代測序技術(shù),第四節(jié)DNA定點(diǎn)誘變技術(shù)自學(xué)）,目前主要用PCR方法進(jìn)行定點(diǎn)誘變也可進(jìn)行突變基于的全合成,第五節(jié)RNA干擾技術(shù),學(xué)習(xí)基因工程之后，在基因剔除技術(shù)部分介紹,第六節(jié)生物芯片,生物芯片BIOCHIP基于微電子技術(shù)和生物信息技術(shù)建立的高度集成化的生物樣本分析方法生物芯片是后基因組時代的利器生物芯片有哪些種類DNAMICROARRAYPROTEINMICROARRAYANTIBODYMICROARRAYCHEMICALCOMPOUNDMICROARRAYTISSUEMICROARRAY,什么是基因芯片技術(shù),基因芯片GENECHIP，一種高通量的核酸雜交方法，又稱DNA微陣列DNAMICROARRAY將大量探針固定與固相支持物，與標(biāo)記的待測樣品進(jìn)行雜交的方法AFFYMETRIX公司已經(jīng)將GENECHIP注冊,如何制作基因芯片,CDNA芯片CDNA片段以顯微打印的方式固定于固相支持物表面，集成度較低原位合成芯片以激光蝕刻技術(shù)直接合成寡核苷酸探針，集成度可達(dá)105點(diǎn)陣/CM2以上,基因芯片能幫助我們干什么,基因表達(dá)譜芯片GENEEXPRESSIONPROFILE基因表達(dá)的大通量分析SNP芯片SINGLENUCLEOTIDEPOLYMORPHISM單核苷酸多態(tài)性的大通量檢測微小RNA芯片MIRNA分析MICRORNA甲基化芯片分析基因組甲基化狀態(tài)CHIPCHIPCHROMATINIMMUNOPRECIPITATION分析DNA與蛋白質(zhì)的相互作用,芯片的主要工作流程,選擇與購買芯片準(zhǔn)備樣品標(biāo)記樣品雜交檢測雜交信號分析處理結(jié)果,第七/八節(jié)蛋白質(zhì)分析方法,蛋白質(zhì)的定量分析ELISAENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAYWESTERNBLOT蛋白質(zhì)的定位免疫組織化學(xué)熒光蛋白的活細(xì)胞定位蛋白質(zhì)相互作用的研究蛋白質(zhì)功能的研究蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),PROTEOMICS,蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)對特定組織細(xì)胞總蛋白的整體性研究,蛋白質(zhì)組學(xué)研究的目的什么,解讀基因組基因組編碼了多少基因蛋白表達(dá)比研究RNA表達(dá)深入了一步蛋白功能超過1/3的蛋白質(zhì)功能不明確蛋白質(zhì)修飾糖基化、磷酸化、酶解等蛋白質(zhì)定位SUBPROTEOME蛋白蛋白相互作用互作是功能的基礎(chǔ),蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)是什么,1975年，雙向電泳技術(shù)建立1990年，更新的EDMAN降解法用于微量蛋白質(zhì)測序，靈敏度達(dá)到PMOL級質(zhì)譜技術(shù)使蛋白測序靈敏度達(dá)到FMOL級基因組計(jì)劃提供了大量的生物信息雙向電泳＋質(zhì)譜＋生物信息分析,等電聚焦＋SDSPAGE,雙向電泳技術(shù),雙向電泳,等電聚焦＋SDSPAGE,雙向電泳的優(yōu)點(diǎn)與缺陷,優(yōu)點(diǎn)比單向電泳有更高的分辨率缺點(diǎn)與解決辦法無法檢測低豐度蛋白分組檢測無法檢測大分子量或脂溶性蛋白酶解電泳圖譜解讀困難自動化分析、DIGE,DIFFERENCEGELELECTROPHORESISDIGE,MASSSPECTROMETRY,肽質(zhì)譜MS分析混合多肽只能確定氨基酸組成，不能分析序列氨基酸質(zhì)譜分析單一肽的氨基酸序列串聯(lián)質(zhì)譜TANDEMMASSSPECTROMETRY，MS/MS可以分析氨基酸序列通過與數(shù)據(jù)庫比較確認(rèn)肽的來源,MS與MS/MS,如何進(jìn)行蛋白蛋白相互作用的分析,酵母雙雜交YEASTTWOHYBRIDIZATION噬菌體展示文庫PHAGEDISPLAYLIBRARY免疫共沉淀COIMMUNOPRECIPITATIONFRETFLUORESCENCERESONANCEENERGYTRANSFER,YEASTTWOHYBRIDIZATION,蛋白質(zhì)相互作用的篩查方法以特定蛋白為釣餌，篩選其相互作用蛋白,如何利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行功能分析,蛋白質(zhì)芯片抗原－抗體鑒定蛋白質(zhì)相互作用鑒定蛋白質(zhì)與小分子相互作用代謝組學(xué)檢測酶活性蛋白質(zhì)功能的高通量分析,本章的主要內(nèi)容是什么,通過本章學(xué)習(xí)了解了哪些核酸和蛋白質(zhì)研究方法什么是分子雜交分子雜交的探針是什么怎樣進(jìn)行標(biāo)記分子雜交有哪些基本方式什么是PCR基本原理是什么PCR反應(yīng)體系是由什么組成的,本章的主要內(nèi)容是什么,什么是RTPCR能用來干什么如何利用PCR進(jìn)行核酸的定量分析什么是基因芯片什么是蛋白質(zhì)組學(xué)核心方法是什么如何進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用的研究,

簡介：常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用THEPRINCIPLEANDAPPLICATIONOFCOMMONUSEDTECHNIQUESINMOLECULARBIOLOGY,分子雜交與印跡技術(shù)MOLECULARHYBRIDIZATIONANDBLOTTINGTECHNIQUE,核酸分子雜交NUCLEICACIDHYBRIDIZATION在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈HETERODUPLEX。,一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理,（一）印跡技術(shù),利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“BLOTTING”，譯為印跡技術(shù)。,用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。,（二）探針技術(shù),二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用,（一）DNA印跡SOUTHERNBLOTTING,（二）RNA印跡NORTHERNBLOTTING,（三）蛋白質(zhì)的印跡WESTERNBLOTTING,用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。,用于RNA的定性定量分析。,用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。,其他斑點(diǎn)印跡DOTBLOTTING原位雜交INSITUHYBRIDIZATIONDNA點(diǎn)陣DNAARRAYDNA芯片技術(shù)DNACHIP,三種印跡技術(shù)的比較,分子雜交實(shí)驗(yàn),①,②,③,,,放射自顯影照片,DNA芯片技術(shù),PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用THEPRINCIPLEANDAPPLICATIONOFPCRTECHNOLOGY,,5?,PRIMER1,,5?,PRIMER2,,,,5?,5?,TEMPLATEDNA,,一、PCR技術(shù)的工作原理,,,,,,,,,,,,,,PCR技術(shù)原理示意圖,PCR的基本反應(yīng)步驟,變性95?C,延伸72?C,退火TM5?C,,,,,模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶DNTPSMG2,PCR體系基本組成成分,利用特異性引物以CDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段,或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接以組織和細(xì)胞的MRNA為模板獲得目的片段；利用簡并引物從CDNA文庫或基因組文庫中獲得序列相似的基因片段；利用隨機(jī)引物從CDNA文庫或基因組文庫中克隆基因。,二、PCR技術(shù)的主要用途,（一）目的基因的克隆,利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。,PCR技術(shù)高度敏感，對模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。,（三）DNA和RNA的微量分析,（二）基因突變,將PCR技術(shù)引入DNA序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度；待測DNA片段既可克隆到特定的載體后進(jìn)行序列測定，也可直接測定。,PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測的敏感性。,（四）DNA序列測定,（五）基因突變分析,逆轉(zhuǎn)錄PCRREVERSETRANSCRIPTIONPCR，RTPCR是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。RTPCR是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對已知序列的RNA進(jìn)行定性及半定量分析的最有效方法。,（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù),三、幾種重要的PCR衍生技術(shù),原位PCRINSITUPCR是在組織切片或細(xì)胞涂片上的單個細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的PCR反應(yīng)，然后用特異性探針進(jìn)行原位雜交，即可檢出待測DNA或RNA是否在該組織或細(xì)胞中存在。原位PCR方法彌補(bǔ)了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。,（二）原位PCR技術(shù),（三）實(shí)時PCR技術(shù),實(shí)時PCRREALTIMEPCR技術(shù)通過動態(tài)監(jiān)測反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。,實(shí)時PCR技術(shù)原理,實(shí)時PCR分類,圖203TAQMAN探針法實(shí)時PCR原理示意圖,基因文庫GENELIBRARY,基因組DNA文庫GENOMICDNALIBRARYCDNA文庫CDNALIBRARY,基因文庫GENELIBRARY,是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。,一、基因組DNA文庫,基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。,用于構(gòu)建基因組文庫的載體有?噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。,基因組文庫和CDNA文庫的構(gòu)建和篩選,第一輪篩選,第二輪篩選,第三輪篩選,基因組文庫篩選結(jié)果舉例,CDNA文庫是包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部MRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的CDNA序列的克隆群體，它以CDNA片段的形式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。,二、CDNA文庫,生物芯片技術(shù)BIOLOGICALCHIPTECHNIQUE,是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進(jìn)行掃描，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對每一位點(diǎn)的熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列DNAMICROARRAY。,一、基因芯片,基因芯片GENECHIP,基因芯片工作流程示意圖,是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。,二、蛋白質(zhì)芯片,蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng),蛋白質(zhì)芯片PROTEINCHIP,蛋白質(zhì)芯片作用原理,生物大分子相互作用研究技術(shù)THEMETHODOFPROTEINPROTEINANDPROTEINDNAINTERACTIONSTUDY,一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù),酵母雙雜交各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析噬菌體顯示系統(tǒng)篩選,常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù),標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)是一個基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。,（一）標(biāo)簽蛋白沉淀,標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。,標(biāo)簽融合蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)流程示意圖,（二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途,酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用,證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用的生物信息學(xué)推測。分析已知存在相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子的的相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。將擬研究的蛋白質(zhì)的編碼基因與BD基因融合成為“誘餌”表達(dá)質(zhì)粒，可以篩選AD基因融合的“獵物”基因表達(dá)文庫，篩選未知的相互作用蛋白質(zhì)。,（三）免疫共沉淀技術(shù)的基本原理和用途,免疫沉淀（IMMUNOPRECIPITATIONIP）免疫沉淀是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法。利用抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性，將抗原（常為靶蛋白）從混合體系沉淀下來。免疫共沉淀（COIMMUNOPRECIPITATION，COIP）免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。COIP與質(zhì)譜分析以細(xì)胞內(nèi)源性靶蛋白為誘餌，用抗靶蛋白抗體與細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀純化靶蛋白免疫復(fù)合物，凝膠電泳分離后，質(zhì)譜鑒定靶蛋白的結(jié)合蛋白,免疫沉淀原理圖解,免疫共沉淀原理圖解,免疫共沉淀原理圖解,蛋白A，蛋白B抗A抗體C進(jìn)行洗脫抗B抗體D進(jìn)行驗(yàn)證,COIP與質(zhì)譜分析流程,,電泳遷移率變動測定ELECTROPHORETICMOBILITYSHIFTASSAY，EMSA或稱凝膠遷移變動實(shí)驗(yàn)GELSHIFTASSAY最初用于研究DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)DNA序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。目前這一技術(shù)也被用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定RNA序列間的相互作用。,二、DNA蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù),（一）電泳遷移率變動測定,凝膠遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖,染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)CHROMATINIMMUNOPRECIPITATIONASSAY,CHIP是目前可以研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的主要方法。,（二）染色質(zhì)免疫沉淀法,染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)流程及結(jié)果示意圖,二、RNA蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù),RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNABINDINGPROTEINIMMUNOPRECIPITATION，RIP），是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)。應(yīng)用范圍研究蛋白與DNA動態(tài)作用研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達(dá)之間的關(guān)系研究蛋白與RNA的相互作用,激光共聚集顯微鏡應(yīng)用技術(shù)LASERSCANNINGCONFOCALMICROSCOPYLSCM,激光經(jīng)放大、分光后由物鏡聚焦于焦平面上，同時，焦平面上被激光掃描的點(diǎn)F所發(fā)出的一定波長的熒光通過檢測針孔光欄達(dá)到檢測器，并成像于顯示器上，得到相應(yīng)的熒光圖象。,激光共聚焦顯微鏡工作原理示意圖,人眼及各類顯微鏡分辯率,人眼分辯率020MM光學(xué)顯微鏡分辯率025UM共焦顯微鏡分辯率018UM電子顯微鏡分辯率020NM激光共聚焦顯微鏡有四個熒光通道，一個透射光通道,激光共聚焦顯微鏡的應(yīng)用,定位、定量三維重組動態(tài)測量?活細(xì)胞或組織內(nèi)游離CA2分布和濃度的變化測量MG2、ZN、NA、K?自由基的檢測?藥物進(jìn)入細(xì)胞的動態(tài)過程、定位分布及定量?蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位活細(xì)胞內(nèi)H濃度（PH值）的測量線粒體膜電位的測量熒光漂白恢復(fù)（FRAP）的測量籠鎖解籠鎖的測量熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）的測量其他應(yīng)用,THANKYOU,

簡介：腫瘤轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué),,,目前，腫瘤治療最棘手的問題，莫過于腫瘤細(xì)胞對傳統(tǒng)治療藥物的抗性和腫瘤轉(zhuǎn)移。因此，進(jìn)一步研究腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，有助于我們尋找預(yù)防措施以及早期診斷和有效治療的新靶點(diǎn)。腫瘤轉(zhuǎn)移的過程受諸多因素影響，近年來腫瘤分子生物學(xué)方面的研究提示，許多基因直接/間接的參與/影響腫瘤的轉(zhuǎn)移。我們首先按照腫瘤轉(zhuǎn)移的過程，作一個大體的介紹。,,腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，必須要克服多個障礙。腫瘤細(xì)胞都必須要逃脫宿主的免疫監(jiān)控。在轉(zhuǎn)移的起始階段，腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位擴(kuò)散并遷移，這一過程涉及到（1）細(xì)胞間作用的調(diào)節(jié)（2）細(xì)胞－基質(zhì)粘附的調(diào)節(jié)（3）腫瘤細(xì)胞的遷移及侵入周圍組織。,,腫瘤細(xì)胞如果要通過全身循環(huán)系統(tǒng)就必須先通過血管內(nèi)皮進(jìn)入瘤內(nèi)血管或者進(jìn)入淋巴管，這個過程稱作“內(nèi)滲”（INTRAVASATION）；然后，再從全身循環(huán)中逃逸出來，這個過程稱作“外滲”（EXTRAVASATION），并最終到達(dá)繼發(fā)部位。在“外滲”過程中，腫瘤細(xì)胞處在與原發(fā)灶差別很大的微環(huán)境中。因此，若要在繼發(fā)組織中生存并增生，腫瘤細(xì)胞必須具有相當(dāng)強(qiáng)的適應(yīng)能力。,,CHAMBER實(shí)驗(yàn)室的研究表明，從單個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到微小轉(zhuǎn)移（MICROMETASTASES）直至產(chǎn)生最終肉眼可見轉(zhuǎn)移的這個過程中，主要限速步驟在“外滲”過程之后。因此，單個細(xì)胞轉(zhuǎn)移或微轉(zhuǎn)移在發(fā)展成為肉眼轉(zhuǎn)移之前，可數(shù)月甚至多年處于休眠狀態(tài)。轉(zhuǎn)移的最終形成受諸多因素/基因的調(diào)控。,1癌基因、抑癌基因與腫瘤轉(zhuǎn)移,許多癌基因被證明與腫瘤的轉(zhuǎn)移過程有關(guān)。例如，在一些人類腫瘤中，經(jīng)?？梢杂^察到小GTP結(jié)合蛋白中的RAS家族存在有突變，在多種細(xì)胞類型出現(xiàn)這種突變時會發(fā)生轉(zhuǎn)移。除RAS以外，其他一些癌基因諸如絲氨酸/蘇氨酸激酶MOS和ROF，以及酪氨酸激酶SRC，F(xiàn)MS和FES的異位表達(dá)也可以在受體細(xì)胞中誘導(dǎo)出具有轉(zhuǎn)移特性的表型。,,此外，在人類腫瘤中，MET和（或）肝細(xì)胞生長因子/擴(kuò)散因子（HGF/SF）的異常表達(dá)經(jīng)常與腫瘤的轉(zhuǎn)移及較差的預(yù)后有關(guān)。最近，從人類腎乳頭狀癌中分離出的活化了的MET基因突變使小鼠細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，并在小鼠模型系統(tǒng)的體外實(shí)驗(yàn)中介導(dǎo)了小鼠細(xì)胞的癌變及轉(zhuǎn)移。當(dāng)把這種突變基因轉(zhuǎn)入小鼠后，小鼠發(fā)生了乳腺的腫瘤。在HGF/SF－MET轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被發(fā)現(xiàn)并證明在轉(zhuǎn)移中起核心作用后，研究者正在尋找可用于治療腫瘤的HGF/SF－MET轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑。,,許多基因通過抑制轉(zhuǎn)移級聯(lián)中的不同作用點(diǎn)來抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。例如，組織特異性基質(zhì)蛋白酶抑制物（TISSUESPECIFICINHIBITOROFMETALLOPROTEINASES,TIMP）及纖維蛋白溶酶活化抑制劑（PLASMINACTIVATORINHIBITOR,PAI）都顯示具有抑制轉(zhuǎn)移的能力。,,一些較傳統(tǒng)的腫瘤抑制物被證明參與腫瘤轉(zhuǎn)移的后期階段。（1）NM23被發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移的黑色素瘤細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)，后來這一現(xiàn)象又在很多其他人類腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中被發(fā)現(xiàn)。（2）PTEN酪氨酸磷酸酶的突變可以在諸如腦、乳腺、前列腺等部位的癌瘤中發(fā)現(xiàn)，而該酶功能的缺失在轉(zhuǎn)移表型的產(chǎn)生過程中起一定作用。,,（3）NF2基因是一種編碼NF2細(xì)胞膜/細(xì)胞骨架連接蛋白的抑癌基因。NF2基因的丟失被證明與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。例如，NF2基因缺失的小鼠易患多種具有轉(zhuǎn)移特性的惡性癌腫。（4）P53功能的丟失促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，不僅是因?yàn)樗谘苌芍械淖饔?，而且還與其在保持遺傳穩(wěn)定性中的重要作用有關(guān)。因此，P53的丟失導(dǎo)致了遺傳上改變的積累，而這些改變可以促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。,,（5）腫瘤轉(zhuǎn)移分子C44A是一類與尿激酶型纖維酶原激活物受體（UROKINASETYPEPLASMINOGENACTIVATORRECEPTOR,UPAR）有某些共同特性的分子。采用RT－PCR及NORTHERNBLOT的方法檢測，人類胎盤組織、皮膚、食管及外周血中的白細(xì)胞都有C44A的表達(dá)。雖然腦、肺、肝、腎、胃、結(jié)腸及淋巴器官起源的腫瘤經(jīng)常可以找到C44AMRNA的存在，但在以上組織器官中卻不能觀察到C44A的表達(dá)。有研究表明，惡性黑色素瘤中C44AMRNA的表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)。即使在痣中找不到C44A的存在或者在原發(fā)黑色素瘤中僅有一小部分瘤細(xì)胞表達(dá)C44A，但在所有轉(zhuǎn)移灶中，C44A都為陽性。鑒于人類與大鼠C44A的高度同源性，及大鼠C44A的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移的密切關(guān)系，人類C44A極有可能成為某些腫瘤的預(yù)后指標(biāo)及潛在的治療靶點(diǎn)。,2腫瘤細(xì)胞的播散與相關(guān)因子,粘附分子中的鈣黏著蛋白及相關(guān)蛋白如Β－聯(lián)蛋白、Α－聯(lián)蛋白及PLAKOGLOBIN構(gòu)成了在轉(zhuǎn)移過程中介導(dǎo)細(xì)胞間粘附的粘附聯(lián)接。E－鈣黏著蛋白介導(dǎo)的粘附作用的丟失與膀胱、胰腺及胃部癌腫浸潤/轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。許多參與轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的生長因子部分通過受體－酪氨酸蛋白激酶轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和鈣黏著蛋白/聯(lián)蛋白復(fù)合物之間的結(jié)合及其隨后發(fā)生的連接蛋白酪氨酸的磷酸化來調(diào)控E－鈣黏著蛋白/聯(lián)蛋白介導(dǎo)的粘附過程。例如，HGF/SF介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的“擴(kuò)散”（SCATTERING）就與Β－聯(lián)蛋白的酪氨酸的磷酸化及鈣黏著蛋白/聯(lián)蛋白的內(nèi)部作用有關(guān)。細(xì)胞內(nèi)粘附分子（INTRACELLULARADHESIONMOLECULES,ICAM）中的免疫球蛋白家族如ICAM－1和ICAM－2也是細(xì)胞間粘附的重要介質(zhì)。這些蛋白表達(dá)的喪失或因突變而失活將有利于腫瘤的播散。高水平的ICAM常常是乳腺癌預(yù)后良好的標(biāo)志物。,3腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動和侵襲,（一）在腫瘤播散過程中，腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動和侵潤是必須的。多種生長因子對腫瘤細(xì)胞的遷移具有趨化和（或）化學(xué)激動（CHEMOKINETIC）的作用。這些因子可以由腫瘤細(xì)胞、周圍間質(zhì)細(xì)胞和（或）浸潤性白細(xì)胞產(chǎn)生，并被這些細(xì)胞以自分泌或旁分泌的形式排出進(jìn)而刺激細(xì)胞的遷移。例如，（1）自分泌運(yùn)動因子（AUTOCRINEMOTILITYFACTOR,AMF）是由某些腫瘤細(xì)胞分泌并結(jié)合到同一細(xì)胞上的AMF受體（GP78），通過自分泌的方式刺激細(xì)胞的運(yùn)動。AMF和（或）GP78的過度表達(dá)已被證明與肺、胃、食管及結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)。,,（2）HGF/SF能有力的促進(jìn)具有MET受體表達(dá)癌細(xì)胞的遷移和侵潤。它主要是由間質(zhì)起源的細(xì)胞合成并以旁分泌的形式排出的。因此，在很多癌腫，特別是那些具有侵潤/轉(zhuǎn)移特性的腫瘤中，經(jīng)常可以觀察到HGF/SF和（或）MET水平升高的現(xiàn)象。例如，高水平的HGF/SF和MET可以在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，特別是在侵潤的邊界區(qū)域里被發(fā)現(xiàn)。而低水平的HGF/SF和MET通常是在較低惡性度的腫瘤，如低惡性度的星形細(xì)胞瘤中被觀察到。,,（二）在細(xì)胞外基質(zhì)（EXTRACELLULARMATRIX,ECM）蛋白水解過程中，尿激酶型纖維酶原激活物（UROKINASETYPEPLASMINOGENACTIVATOR,UPA）/纖維蛋白溶酶網(wǎng)絡(luò)及基質(zhì)金屬蛋白酶（MATRIXMETALLOPROTEINASE，MMP）的活化在腫瘤細(xì)胞的侵潤過程中是關(guān)鍵。,,因此，在患有諸如乳腺、肺、腎臟、結(jié)腸、胃部及軟組織等部位惡性腫瘤的病人體內(nèi)，UPA、UPAR和（或）纖維蛋白溶酶活化抑制劑PA－1的活性增高或過度表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展與較差的預(yù)后相關(guān)。在腦腫瘤中，高水平表達(dá)UPA和（或）UPAR可以在高惡性度的腫瘤中，特別是在腫瘤浸潤的邊緣區(qū)域被觀察到，而通過運(yùn)用抑制UPAR合成的反義基因治療，可以抑制裸鼠體內(nèi)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的形成。UPAR還可以與ECM中的?；Y(jié)合素相結(jié)合，從而參與ECM所介導(dǎo)的粘附過程、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞運(yùn)動及浸潤。UPAR的這些作用與它在ECM蛋白水解中所起的作用是相互獨(dú)立的。,,基質(zhì)金屬蛋白酶（MATRIXMETALLOPROTEINASE，MMP）家族中的多種成員及其抑制劑（TIMP）的異常表達(dá)可在多種癌腫觀察到，并且常與癌腫的浸潤及轉(zhuǎn)移相關(guān)。例如，MMP2與MMP9都參與膠質(zhì)細(xì)胞瘤的進(jìn)展及其浸潤。許多可以誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移的生長因子已被證明可以調(diào)控UPA纖維蛋白溶酶網(wǎng)絡(luò)和（或）MMP的活性/表達(dá)。例如，HGF/SF可以在多種腫瘤細(xì)胞系中誘導(dǎo)UPA和UPAR的表達(dá)。在人類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤受HGF/SF刺激后，MTMMP1及MMP2的表達(dá)/活化都上升。,,（三）腫瘤細(xì)胞若要發(fā)生遷移及浸潤就必須與細(xì)胞外基質(zhì)粘附。細(xì)胞粘附分子中的整聯(lián)蛋白家族在轉(zhuǎn)移過程中可以介導(dǎo)ECM及基底膜的粘附。多種不同的整聯(lián)蛋白的亞單位都參與腫瘤轉(zhuǎn)移的過程。由于各種組織環(huán)境中ECM的差異，不同的腫瘤細(xì)胞在浸潤及遷移過程中可以合成分泌多種不同的整聯(lián)蛋白。以人類黑色素瘤為例，某些整聯(lián)蛋白如Α2Β1，Α3Β1及Α6Β1表達(dá)的調(diào)高與腫瘤的進(jìn)展程度及轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。,,（四）一旦與ECM發(fā)生粘附后，腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動、浸潤及生存都由整聯(lián)蛋白所介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來調(diào)控。整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的FAK的活化引起多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子如SRC,PI3－激酶及MAPK1/2的激活。它們都是細(xì)胞運(yùn)動及浸潤的重要介導(dǎo)者。有趣的是，由腫瘤抑制劑PTEN編碼的一種胞質(zhì)酪氨酸磷酸酶可以使PI3激酶產(chǎn)生的肌醇脂（INOSITOLLIPIDS）及其它的灶性接觸成分（FOCALCONTACTS）如FAK及SHC等脫磷酸。因此，PTEN的過度表達(dá)可以抑制整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。相反，PTEN功能的喪失將導(dǎo)致整聯(lián)蛋白調(diào)控的癌變及轉(zhuǎn)移的產(chǎn)生。,,許多非整聯(lián)蛋白糖蛋白在腫瘤細(xì)胞的浸潤及轉(zhuǎn)移中也參與細(xì)胞－ECM的粘附以及其后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化過程。由同一基因經(jīng)不同剪接方式所產(chǎn)生的跨膜糖蛋白CD44的多種同工型蛋白是ECM成分之一的透明質(zhì)酸酶的受體，并被證明參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移。尤其是CD44V3的同工型，它的胞外部分含有肝素硫酸鹽（HEPARINSULFATE），可以與肝素硫酸鹽生長因子（HEPARINSULFATEBINDINGGROWTHFACTOR）結(jié)合，并被證明與腫瘤的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。CD44V3還可以與HGF/SF結(jié)合并且促進(jìn)由HGF/SF所介導(dǎo)的MET受體的活化過程。,4腫瘤細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的存活,腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)后所面對的兩大主要障礙是自身的凋亡及宿主的免疫監(jiān)控。（1）如果上皮細(xì)胞由于整聯(lián)蛋白所介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的丟失而沒有與ECM發(fā)生粘附作用，上皮細(xì)胞通常發(fā)生凋亡。這是因?yàn)?，由整?lián)蛋白介導(dǎo)的FAK，PI3激酶及AKT（蛋白激酶B，PROTEINKINASEB）的活化可以抑制細(xì)胞的凋亡。腫瘤細(xì)胞在與ECM粘附過程中不斷發(fā)生自身的修飾，并通過改變整聯(lián)蛋白、整聯(lián)蛋白相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和（或）凋亡調(diào)控劑而避免凋亡的發(fā)生。,,（2）循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞對宿主的免疫細(xì)胞特別易感。但在某些情況下，腫瘤細(xì)胞似乎可以擊退某些參與腫瘤免疫監(jiān)控的細(xì)胞。例如，某些結(jié)腸癌細(xì)胞可以通過表達(dá)FAS配體從而誘導(dǎo)具有FAS受體的T細(xì)胞發(fā)生凋亡。另外，腫瘤細(xì)胞可以通過掩蓋其表面的抗原來逃避循環(huán)中淋巴細(xì)胞的識別。尤其是腫瘤細(xì)胞表面的糖類，他們經(jīng)常發(fā)生改變，這使得腫瘤細(xì)胞能夠逃脫宿主的免疫反應(yīng)。淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的粘附在免疫識別過程中起著十分重要的作用。所以，包括ICAM－1等在內(nèi)的嗜異染細(xì)胞粘附分子極有可能是腫瘤－淋巴細(xì)胞粘附過程的重要介體。,5腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附,當(dāng)?shù)竭_(dá)繼發(fā)組織的毛細(xì)血管床后，腫瘤細(xì)胞便開始沿著內(nèi)皮層移行。內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的選擇蛋白（SELECTINS）介導(dǎo)了內(nèi)皮細(xì)胞與表達(dá)有某種唾液酸寡糖（SIALYLATEDOLIGOSACCHARIDES）的腫瘤細(xì)胞之間的最早的細(xì)胞接觸。整聯(lián)蛋白也在轉(zhuǎn)移過程中介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞－內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附。腫瘤轉(zhuǎn)移的模式不僅由循環(huán)系統(tǒng)的解剖所決定，還與擴(kuò)散的腫瘤細(xì)胞到達(dá)的繼發(fā)組織之特定部位有關(guān)，這一觀點(diǎn)已被廣泛接受。,,這個由PAGET早在1889年就提出的“種子與土壤”假說直到最近才開始在分子水平上被充分理解。組織特異性的腫瘤細(xì)胞是決定轉(zhuǎn)移的組織特異性的主要因素。已有噬菌體文庫顯示，某些多肽能夠?qū)颍℉OMING）不同組織內(nèi)的內(nèi)皮層。最近，有研究證明，含有天冬氨酸－甘氨酸－精氨酸（NGR）序列的多肽通過與腫瘤血管所表達(dá)的氨肽酶N（CD13）結(jié)合，可特異性導(dǎo)向腫瘤血管系統(tǒng)。這些研究使我們對內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤特異性轉(zhuǎn)移中的作用有了進(jìn)一步的了解，并且會對未來開發(fā)有效的腫瘤治療方法產(chǎn)生巨大影響。,6腫瘤轉(zhuǎn)移后休眠－血管生成,腫瘤轉(zhuǎn)移過程的限速步驟在于休眠細(xì)胞向微小轉(zhuǎn)移的發(fā)展轉(zhuǎn)化，這一觀點(diǎn)為今后的研究提供了方向。臨床上，轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是很難治療的。因?yàn)椋谠l(fā)腫瘤確診或在開始治療時，出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者的病情往往已經(jīng)很嚴(yán)重。現(xiàn)在普遍認(rèn)為，腫瘤在早期階段就發(fā)生了微小轉(zhuǎn)移，而肉眼可見轉(zhuǎn)移直到后期階段才發(fā)生。而血管生成在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中具有核心作用。,,FOLKMAN實(shí)驗(yàn)室在分離血管抑素ANGIOSTATIN過程中所做的研究工作是最好的例證。患有原發(fā)腫瘤而無轉(zhuǎn)移跡象的小鼠在原發(fā)灶被切除后出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移的表現(xiàn)。研究顯示，原發(fā)腫瘤在實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)產(chǎn)生了高水平的血管抑素，它能抑制繼發(fā)灶的血管形成，因而使微小轉(zhuǎn)移灶保持在無血管、無癥狀的休眠狀態(tài)。,,CHAMBER實(shí)驗(yàn)小組及其他遍布全球的實(shí)驗(yàn)室所做的工作已經(jīng)開始揭示轉(zhuǎn)移級聯(lián)的組成及參與這一過程的諸多因子。例如，實(shí)驗(yàn)顯示，利用MMP的抑制劑BATIMASTAT可以減少小鼠黑色素瘤發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的機(jī)會，這一現(xiàn)象并不是如以往所設(shè)想的那樣通過減少瘤細(xì)胞的“外滲”，而是通過抑制血管生成達(dá)到的。因此，轉(zhuǎn)移過程的后期階段可以當(dāng)作一個很好的治療窗。轉(zhuǎn)移休眠狀態(tài)中所參與因素的發(fā)現(xiàn)以及對腫瘤－宿主的相互作用的研究，將有助于我們開發(fā)針對腫瘤轉(zhuǎn)移的新的治療措施。,基質(zhì)金屬蛋白酶MMPS及其組織抑制物TIMPS與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移,,,我們說，腫瘤的進(jìn)程包括正常細(xì)胞某些基因的改變、惡性表型的形成、侵襲臨近正常組織、遠(yuǎn)距離及全身組織擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性不同于正常細(xì)胞，近年來，通過對這些細(xì)胞及其所依賴的細(xì)胞外環(huán)境中各種不同類型分子與腫瘤間質(zhì)之間相互關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)了許多新的黏附分子、細(xì)胞移動分子及各種類型的降解酶。腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的成功在很大程度上正是依賴于這些酶降解了一系列的組織屏障（屏障的主要成分包括有，各型膠原、層粘連蛋白、纖粘連蛋白、彈力蛋白和蛋白多糖等）。在這些降解酶中，對MMPS及其組織抑制因子TIMPS的研究最多，兩者表達(dá)的動態(tài)平衡決定了細(xì)胞外基質(zhì)的降解程度，繼而也決定了腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。,MMPS,MMPS是具有高度同源性的能降解基底膜的水解酶類，至今已發(fā)現(xiàn)有23種，在人體內(nèi)至少有19種，構(gòu)成MMPS超家族。按照MMPS各成員作用的底物特異性，可將它們分為以下幾類膠原酶，MMP1、8、13；明膠酶，MMP2、9；基質(zhì)溶酶，MMP3、10、11；膜型基質(zhì)金屬蛋白酶，MMP14、15、16、17；以及其他類，MMP7、12、18、19、20、21、22。,,MMPS的存在方式有前酶型、活化酶型以及與組織抑制因子結(jié)合的復(fù)合物型，其存在方式與腫瘤的種類及惡性程度密切相關(guān)。MMPS產(chǎn)生于正常組織細(xì)胞（包括有結(jié)締組織細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、胸腺細(xì)胞等）和腫瘤細(xì)胞中，以前酶的形式分泌。它們的結(jié)構(gòu)具有高度同源性，其肽鏈中都含有兩個ZN2、兩個CA2和一個半胱氨酸開關(guān)，它可以封閉或暴露活性中心2價陽離子并維持酶蛋白的穩(wěn)定。MMPS一般都含有三個結(jié)構(gòu)域即N末端前肽域、催化域和C末端類血紅素域，而后兩個域區(qū)較為保守。,,MMPS的活化機(jī)制尚未明了，一般認(rèn)為MMP的活化是一個由其他MMP及血清蛋白酶介導(dǎo)的級聯(lián)水解過程，切除N末端前肽并將半胱氨酸與鋅離子分離，暴露活性中心而活化；在體外可被一系列有機(jī)汞試劑、烷基化試劑、氧化試劑及一些水解酶試劑活化。MMPS的功能主要有降解細(xì)胞外基質(zhì)膜有效成分、調(diào)節(jié)細(xì)胞黏著、作用于細(xì)胞外組分或其他蛋白成分而啟動潛在的生物學(xué)功能、直接或間接參與胚胎發(fā)育、組織模型再塑及創(chuàng)傷修復(fù)等正常生理過程。一般認(rèn)為活化型MMP與其組織抑制因子11比例的結(jié)合將導(dǎo)致MMP功能的抑制。,,MMPS活性的調(diào)節(jié)機(jī)制包括A酶自身代謝的調(diào)節(jié)、B天然抑制因子的調(diào)節(jié)C轉(zhuǎn)錄調(diào)控。（1）代謝調(diào)節(jié)，就是MMPS的合成與分解的調(diào)節(jié)，包括有，前酶的合成分泌、前酶的前肽域水解、酶的活化、酶的降解失活。代謝過程中酶的活化又有生理的激活和病理的激活。生理情況下，由血漿纖溶酶系統(tǒng)和間質(zhì)溶解素介導(dǎo)，由MMP級聯(lián)效應(yīng)激活、尿激酶型或組織型纖溶酶原激活物激活纖溶酶原，活化的纖溶酶再激活基質(zhì)金屬蛋白酶。而病理情況下，則是由許多的細(xì)胞內(nèi)外信息傳導(dǎo)分子誘導(dǎo)而產(chǎn)生病理性激活因子繼而再作用于基質(zhì)金屬酶使之活化。,,（2）抑制因子的調(diào)節(jié)有特異性和非特異性A特異性抑制因子調(diào)節(jié)指的是MMPS的天然抑制物TIMPS對MMPS的調(diào)節(jié)，一般認(rèn)為TIMPS特異結(jié)合活化型的MMP可以導(dǎo)致MMP的功能失活；B非特異性抑制因子則是某些蛋白質(zhì)如Α2巨球蛋白以及一些肽類衍生物或非肽類衍生物，它們以結(jié)合MMPS的鋅離子活性中心而使酶失活。（3）轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制則尚未完全明了。,TIMPS,按照TIMP發(fā)現(xiàn)的先后、分子結(jié)構(gòu)同源以及功能上的相關(guān)性可分為四類TIMP1,2,3,4。TIMPS廣泛分布于組織及體液中，主要由巨噬細(xì)胞和結(jié)締組織產(chǎn)生。TIMP1,2,4以可溶性小分子量多肽的形式分泌；而小分子量多肽TIMP3則是以不溶性形式分泌，而且與分泌細(xì)胞和基質(zhì)組分間的相互作用機(jī)制有關(guān)，目前僅發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞外基質(zhì)中；TIMP4的表達(dá)更具有組織特異性，其分泌水平在各臟器差異較大，而以心臟最為豐富。,,TIMPS的結(jié)構(gòu)具有一定的同源性，有兩個功能區(qū)N末端功能區(qū)為一個大三環(huán)結(jié)構(gòu)，其中的半胱氨酸殘基為與MMPS鋅離子活性中心結(jié)合的區(qū)域；C末端功能區(qū)為一較小的三環(huán)結(jié)構(gòu)，該功能區(qū)在TIMPS定位和/或與前MMPS形成復(fù)合物方面有重要意義。,,TIMPS的功能主要是天然地抑制MMPS，在調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的代謝中起重要作用。其作用方式較為復(fù)雜，大多數(shù)情況下是和MMPS以11的比例結(jié)合成復(fù)合物，使MMPS失活。近來發(fā)現(xiàn)有的TIMPS可以與MMPS的C末端類血紅素區(qū)作用，而調(diào)節(jié)MMPS活性。此外，TIMP2還在細(xì)胞生長、繁殖及刺激血管生成等生理和病理學(xué)方面發(fā)揮一定的作用；TIMP3甚至能直接作用于細(xì)胞周期的調(diào)控，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。,,TIMPS的調(diào)控機(jī)制研究不多。一般認(rèn)為其表達(dá)調(diào)控主要是受細(xì)胞內(nèi)的某些激酶以及胞內(nèi)外的某些激素和一些信息分子、效應(yīng)分子所誘導(dǎo)。各類TIMPS表達(dá)的調(diào)控有差異TIMP1的調(diào)控有強(qiáng)刺激反應(yīng)性，在對成纖維細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)FGF、PDGF、IL1等均能強(qiáng)調(diào)節(jié)其表達(dá)，有研究更揭示TIMP1至少間接受到RAS原癌基因的調(diào)控；TIMP2的表達(dá)調(diào)控與MMP2相關(guān)，大多與前MMP2形成復(fù)合體的形式分泌；TIMP3與其他TIMPS僅有25的氨基酸同源性，其調(diào)控與細(xì)胞周期之間有復(fù)雜關(guān)系，為TIMP3所獨(dú)有；而TIMP4的表達(dá)則體現(xiàn)出組織器官特異性，具體機(jī)制還不清楚。,,腫瘤細(xì)胞與其所依賴的細(xì)胞外間質(zhì)之間相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)代謝平衡的失調(diào)，從而引發(fā)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。細(xì)胞外基質(zhì)代謝主要涉及到基質(zhì)有效成分的生成與降解，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中這一代謝的失衡表現(xiàn)為對細(xì)胞外基質(zhì)有效成分降解的增強(qiáng)。盡管胞外基質(zhì)成分復(fù)雜，且涉及的降解酶種類較多，但人們發(fā)現(xiàn)MMPS在對胞外基質(zhì)有效成分降解的過程中起著關(guān)鍵的作用。越來越多的研究表明，惡性表型和侵襲轉(zhuǎn)移表型的細(xì)胞均高表達(dá)MMPS水平。,,在形成細(xì)胞外基質(zhì)的兩大部分即基底膜和間質(zhì)中，基底膜構(gòu)成一道阻滯屏障，該屏障以基膜膠原即IV型膠原為主要成分，故對其降解成為細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，IV型膠原酶MMP2，MMP9因此被研究得最多。不同種類的腫瘤，特別是乳腺癌其惡性程度與MMP2、MMP9過多表達(dá)有正相關(guān)。同時有些研究還發(fā)現(xiàn)，MMP2、MMP9與TIMPS特別是TIMP1,2相互作用的結(jié)果與腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，MMP2/TIMP2比值甚至作為一些腫瘤惡性程度及預(yù)后判斷的一項(xiàng)指標(biāo)。,,在MMPS超家族其他成員及TIMPS與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移的研究中，發(fā)現(xiàn)有些MMP可表現(xiàn)與惡性表型和侵襲轉(zhuǎn)移表型相關(guān)的高表達(dá)水平，而有些MMP的表達(dá)則與此無相關(guān)性，有的甚至檢測不到表達(dá)，呈現(xiàn)典型的不均一性，而且也呈現(xiàn)功能上的差異。,,對TIMPS的研究也顯示類似的結(jié)果。一般認(rèn)為，TIMPS天然抑制MMPS，在某些條件下卻表現(xiàn)出調(diào)節(jié)MMPS活性，這是通過與后者的類血紅素結(jié)合區(qū)作用而實(shí)現(xiàn)的，在有些情形下更表現(xiàn)出促腫瘤進(jìn)程，如BAKER等發(fā)現(xiàn)，低濃度的TIMPS啟動MMP2活化，TIMP1等不能抑制MT1MMP；TIMP1,2發(fā)揮類似生長因子的作用，TIMP3在腫瘤細(xì)胞循環(huán)周期中發(fā)揮特有的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，TIMP4既能抑制腫瘤侵襲也能抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，其在心臟中的高表達(dá)也許說明了有些器官組織很少惡性變的部分機(jī)理。,,綜上所述，MMPS及TIMPS與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系十分復(fù)雜，從理論上講二者間動態(tài)平衡的改變是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移成功的關(guān)鍵因素。高表達(dá)MMPS水平和相對低表達(dá)TIMPS水平在很多惡性表型和侵襲轉(zhuǎn)移表型腫瘤的研究中得到了證實(shí)。但在對有些腫瘤的研究中，這一現(xiàn)象卻得不到驗(yàn)證，尤其是TIMPS的作用更加復(fù)雜，往往表現(xiàn)相悖的結(jié)果。所以對不同的腫瘤表型要作具體的相關(guān)分析。,抑癌基因與腫瘤轉(zhuǎn)移,腫瘤轉(zhuǎn)移是一個由多種基因參與的過程。在此過程中，一方面是許多正常的細(xì)胞基因過度表達(dá)，如IV型膠原蛋白酶，識別細(xì)胞外基質(zhì)的某些整合蛋白、轉(zhuǎn)基因子及其受體、各種生長因子及其受體如BFGF等，從而使得細(xì)胞更具粘附性、浸潤性、運(yùn)動性及繁殖能力；另一方面是一些抑癌基因和轉(zhuǎn)移抑制基因的丟失和失活。,,作為抑癌基因通常必須滿足以下兩個條件①該基因在與腫瘤相應(yīng)的正常組織中表達(dá)，但在該腫瘤中則存在缺陷，如在直腸癌中，DCC、P53、RB、NF1、APC/MCC等抑癌基因出現(xiàn)等位基因丟失；②如果導(dǎo)入該基因，則腫瘤生長受抑或部分受抑。,,到目前為止，已發(fā)現(xiàn)有多種抑癌基因，大致可分為以下幾類A跨膜受體類，如DCC基因；B胞質(zhì)調(diào)節(jié)因子或結(jié)構(gòu)蛋白類，如PTEN、NF2；C轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子類，如VHL、P53；D細(xì)胞周期因子類，如P16、P15、P21；EDNA損傷修復(fù)因子類，如MLH、ATM等；F其它類。,,細(xì)胞粘附能力下降是腫瘤轉(zhuǎn)移的因素之一。正常細(xì)胞表面存在多種介導(dǎo)細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)ECM之間粘附的分子，如神經(jīng)細(xì)胞黏附分子NCAM、E鈣黏著蛋白ECADHERIN、選凝素，細(xì)胞通過其粘附分子的胞外部分和ECM發(fā)生粘附、識別，然后通過粘附分子的胞內(nèi)部分與骨架蛋白?、?連環(huán)蛋白CATENIN、黏著斑蛋白VINCULIN、根蛋白RADIXIN等相連，從而將細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長。因此，上述過程任一環(huán)節(jié)的缺失將使細(xì)胞粘附能力下降，促使腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移。目前已發(fā)現(xiàn)有多種抑癌基因編碼的蛋白與細(xì)胞粘附有關(guān)，它們的失活將使細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能增加。,,下面以與細(xì)胞粘附有關(guān)的幾個抑癌基因?yàn)槔?，簡要說明它們與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。1DCC基因該基因含有14MBP和29個外顯子，其表達(dá)產(chǎn)物為190KD的跨膜磷蛋白，膜外有1100個氨基酸，膜內(nèi)有324個氨基酸。值得注意的是DCC的氨基酸序列與NCAM及其它相關(guān)的細(xì)胞表面糖蛋白具有同源性，這提示DCC功能的丟失可能導(dǎo)致細(xì)胞間接觸、粘附能力下降，從而提高癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。,,2NF2基因該基因位于染色體22Q12，其編碼產(chǎn)物MERLIN為66KD的細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，與其它骨架相關(guān)蛋白具有同源性，介導(dǎo)細(xì)胞骨架蛋白與細(xì)胞膜連接，參與細(xì)胞骨架信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)及細(xì)胞間接觸，提示NF2與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)22QLOH與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。,,3PTEN基因該基因?yàn)樾掳l(fā)現(xiàn)的抑癌基因，位于10Q233，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為515KBMRNA。其蛋白產(chǎn)物含有一酪蛋白磷酸酶的功能區(qū)和約175個氨基酸左右的與骨架蛋白TENASIN、AUXILIN同源的區(qū)域。PTEN可能通過去磷酸化參與細(xì)胞調(diào)控。磷酸化和去磷酸化是調(diào)節(jié)細(xì)胞活動的重要方式，許多癌基因的產(chǎn)物都是通過磷酸化而刺激細(xì)胞生長。因此，PTEN可能與酪氨酸激酶競爭共同的底物，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。,細(xì)胞間黏附分子1與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系,細(xì)胞間黏附分子1（ICAM1）是體內(nèi)重要的免疫活性

簡介：藥學(xué)分子生物學(xué)PHARMACEUTICALMOLECULARBIOLOGY,生化教研室肖建英,緒論,一、分子生物學(xué)與藥學(xué)分子生物學(xué)二、分子生物學(xué)發(fā)展的回顧三、分子生物學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)藥科學(xué),醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)的永恒主題,生命是什么,1分子生物學(xué)MOLECULARBIOLOGY的概念,從分子水平研究生命現(xiàn)象的科學(xué)，是現(xiàn)代生命科學(xué)的“共同語言”。,一、分子生物學(xué)與藥學(xué)分子生物學(xué),核心內(nèi)容是通過生物的物質(zhì)基礎(chǔ)核酸、蛋白質(zhì)、酶等生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能及其相互作用等運(yùn)動規(guī)律的研究來闡明生命分子基礎(chǔ)，從而探討生命的奧秘。,2、分子生物學(xué)的產(chǎn)生與發(fā)展,生物化學(xué)遺傳學(xué)細(xì)胞生物學(xué)生物物理學(xué)微生物學(xué)有機(jī)化學(xué)物理化學(xué),分子生物學(xué)的研究和發(fā)展軌跡,分子生物學(xué)不斷地與其他學(xué)科進(jìn)行深入的橫向聯(lián)系和交叉融合分子、細(xì)胞、整體水平的研究得到和諧統(tǒng)一表型和基因型的關(guān)系得到客觀準(zhǔn)確解釋,分子生物學(xué)打破了學(xué)科的界線分子生物學(xué)把各學(xué)科聯(lián)系在一起,分子生物學(xué)與其他學(xué)科的結(jié)合,,生理學(xué),微生物學(xué),免疫學(xué),病理學(xué),藥理學(xué),分子生物學(xué),,臨床醫(yī)學(xué),分子生物學(xué)廣泛滲透到醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)重要的基礎(chǔ),分子生物學(xué)的學(xué)科地位,是當(dāng)前生命科學(xué)中發(fā)展最快的前沿領(lǐng)域，即生命科學(xué)的領(lǐng)先學(xué)科。是與其它學(xué)科廣泛交叉與滲透的重要前沿領(lǐng)域現(xiàn)代生命科學(xué)的內(nèi)涵和外延在不斷擴(kuò)大。,分子生物學(xué)大大促進(jìn)了醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展,3、分子生物學(xué)的研究對象,生物大分子的結(jié)構(gòu)大分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系生物大分子在遺傳信息和細(xì)胞信息傳遞中的作用,一、核酸（基因）的分子生物學(xué)核酸的結(jié)構(gòu)與功能、基因組、基因信息的傳遞及調(diào)控、基因操作、基因診斷與基因治療等。二、蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)（包括酶與生物催化劑）蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，生物大分子間的相互作用三、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子生物學(xué)研究細(xì)胞間通訊和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制四、癌基因與抑癌基因、肽類生長因子、細(xì)胞周期及其調(diào)控的分子機(jī)理等。五、分子生物學(xué)技術(shù)主要包括分子雜交技術(shù)、鏈反應(yīng)技術(shù)、基因工程與蛋白質(zhì)工程等。,研究的具體內(nèi)容,結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)研究基因組研究基因表達(dá)的調(diào)控研究細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究,,目前分子生物學(xué)研究的前沿,4、藥學(xué)分子生物學(xué)PHARMACEUTICALMOLECULARBIOLOGY,分子生物學(xué)的新理論和新技術(shù),藥學(xué)研究領(lǐng)域,,,藥學(xué)分子生物學(xué),滲入,誕生,生命科學(xué)藥學(xué)化學(xué),,,藥學(xué)化學(xué),,,二、分子生物學(xué)發(fā)展的回顧,1868年FRIDRICHMIESCHER從膿細(xì)胞中提取“核酸”1903年染色體是遺傳單位1910年基因位于染色體上1913年染色體包含線性排列的基因1927年突變是基因內(nèi)的物理變化1931年交換引起基因重組1944年AVERY等人證實(shí)DNA是遺傳物質(zhì)1945年基因編碼蛋白質(zhì)1951年首次蛋白質(zhì)測序1953年WATSON和CRICK發(fā)現(xiàn)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu),1954年CRICK提出分子生物學(xué)的中心法則1958年DNA半保留復(fù)制1961年NIRENBERG發(fā)現(xiàn)遺傳密碼1967年發(fā)現(xiàn)DNA連接酶1973年建立了DNA重組技術(shù)1975年TEMIN和BALTIMORE發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶1981年GILBERT和SANGER建立DNA測序方法1985年MULLIS發(fā)明PCR技術(shù)1990年美國啟動人類基因組計(jì)劃HGP1994年中國人類基因組計(jì)劃啟動1997年第一只克隆羊多莉誕生2001年美、英等國完成人類基因組計(jì)劃基本框架2003年人類基因組序列圖繪制成功,1、誕生的準(zhǔn)備和醞釀階段19世紀(jì)后期20世紀(jì)50年代初。在這一階段產(chǎn)生了兩點(diǎn)對生命本質(zhì)認(rèn)識上的重大突破1確定了蛋白質(zhì)是生命的主要物質(zhì)基礎(chǔ),分子生物學(xué)發(fā)展的三個階段,19世紀(jì)末BUCHNER第一次提出酶（ENZYME）的名稱，酶是生物催化劑。,1902年EMILFISHER證明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是多肽；,40年代末，SANGER創(chuàng)立氨基酸序列分析法。,1950年P(guān)AULING和COREY提出了Α螺旋結(jié)構(gòu)模型。,2確定了生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA,1868年FMIESCHER就發(fā)現(xiàn)了核素（NUCLEIN）,20世紀(jì)2030年代已確認(rèn)自然界有DNA和RNA兩類核酸,1944年OTAVERY等證明了肺炎球菌轉(zhuǎn)化因子是DNA；,1952年ADHERSHEY和MCHASE用DNA35S和32P分別標(biāo)記T2噬菌體的蛋白質(zhì)和核酸，感染大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了DNA是遺傳物質(zhì)。,194952年SFURBERY等的X線衍射分析闡明了核苷酸并非平面的空間構(gòu)像，提出了DNA是螺旋結(jié)構(gòu)；,19481953年提出了DNA鹼基組成AT、GC的CHARGAFF規(guī)則，,2、現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立和發(fā)展階段從20世紀(jì)50年代初70年代初。,1953年WATSON和CRICK提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型是現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生的里程碑。開創(chuàng)了分子遺傳學(xué)基本理論建立和發(fā)展的黃金時代。,DNA雙螺旋發(fā)現(xiàn)的最深刻意義在于確立了核酸作為信息分子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)提出了鹼基配對是核酸復(fù)制、遺傳信息傳遞的基本方式；從而最后確定了核酸是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，,此期間的主要進(jìn)展包括1遺傳信息傳遞中心法則的建立,2對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的進(jìn)一步認(rèn)識,195658年ANFINSEN和WHITE根據(jù)對酶蛋白的變性和復(fù)性實(shí)驗(yàn)，提出蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)是由其氨基酸序列來確定的。,1969年WEBER開始應(yīng)用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量；,1973年氨基酸序列自動測定儀問世。,1965年中國科學(xué)家人工合成了牛胰島素。,3、初步認(rèn)識生命本質(zhì)并開始改造生命的深入發(fā)展階段70年代后，以基因工程技術(shù)的出現(xiàn)作為新的里程碑，標(biāo)志著人類深入認(rèn)識生命本質(zhì)并能動改造生命的新時期開始。,三、分子生物學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)藥科學(xué),（一）分子生物學(xué)在發(fā)病機(jī)制和藥學(xué)研究中的作用,1、遺傳性高脂血癥可誘發(fā)冠狀動脈粥樣硬化2、對某些病毒致病作用的研究乙肝與肝癌3、認(rèn)識了某些遺傳疾病的發(fā)病機(jī)制,（二）分子生物學(xué)在疾病診斷中的作用如基因芯片的應(yīng)用。,（三）分子生物學(xué)在疾病治療中的作用,（四）分子生物學(xué)在醫(yī)藥工業(yè)中的作用,1、DNA重組技術(shù)與新藥研究常見的重組藥物,2、藥物基因組學(xué)、藥物蛋白質(zhì)組學(xué)與現(xiàn)代藥物,（1）藥物基因組學(xué)是主要以闡明藥物代謝、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和藥物靶分子的基因多態(tài)性與藥物作用包括療效和毒副作用之間關(guān)系的一門科學(xué)，是一門新興的研究領(lǐng)域。,研究的分子基礎(chǔ)是基因多態(tài)性，因此可指導(dǎo)藥物設(shè)計(jì)、開發(fā)新藥及合理用藥。,（2）藥物蛋白質(zhì)組學(xué)是基因、蛋白質(zhì)、疾病三者相連的橋梁科學(xué)。其研究內(nèi)容比藥物基因組學(xué)更復(fù)雜。,復(fù)習(xí)思考題1、何謂分子生物學(xué)何謂藥學(xué)分子生物學(xué)2、分子生物學(xué)研究的主要內(nèi)容是什么分子生物學(xué)研究在醫(yī)藥領(lǐng)域有何應(yīng)用3、了解分子生物學(xué)發(fā)展的重大事件。,

簡介：CHAPTER2,INTERRUPTEDGENES斷裂基因,21INTRODUCTION簡介,真核生物基因組包含的斷裂基因由間隔的外顯子EXON表現(xiàn)在最終的RNA產(chǎn)物中的序列和內(nèi)含子INTRON從初始轉(zhuǎn)錄物中去除的序列組成外顯子序列在基因和RNA中的順序是一致的,但由于內(nèi)含子的存在,斷裂基因的長度大于它的最終RNA產(chǎn)物的長度,斷裂基因表達(dá)成前體RNA,內(nèi)含子剪切除去后,外顯子剪接連接在一起,而MRNA只含有外顯子的序列,22ANINTERRUPTEDGENECONSISTSOFEXONSANDINTRONS斷裂基因由外顯子與內(nèi)含子組成,內(nèi)含子只在RNA的順式剪接加工過程中被去除只有外顯子中的突變才會影響蛋白質(zhì)的序列,但內(nèi)含子中的突變會影響RNA的剪接從而抑制蛋白質(zhì)的產(chǎn)生,外顯子在MRNA中的順序與其在DNA中的相同,但是基因長度與MRNA長度或蛋白質(zhì)長度之間并不相關(guān)基因中AB之間的距離短但在MRNA和蛋白質(zhì)中AB之間的距離比BC之間的距離長,23RESTRICTIONENDONUCLEASESAREAKEYTOOLINMAPPINGDNA限制性內(nèi)切酶是DNA作圖中的關(guān)鍵工具,限制性核酸內(nèi)切酶RESTRICTIONENDONUCLEASES可以用來將DNA剪切成特定的片段用不同限制性內(nèi)切核酸酶作用,可產(chǎn)生一系列DNA片段,通過疊加方法則可用于DNA作圖,限制酶作用產(chǎn)生的DNA切割片段按照它們的大小而分開,限制圖譜表示的是DNA上以限定長度而分開的所有位點(diǎn)的線性次序該圖確定了酶A和酶B的酶切位點(diǎn),它們由單酶切和雙酶切消化所產(chǎn)生的不同片段來確定,24ORGANIZATIONOFINTERRUPTEDGENESMAYBECONSERVED斷裂基因的組成結(jié)構(gòu)可能是保守的,通過限制圖譜或電子顯微鏡技術(shù)比較基因與它們的RNA產(chǎn)物,如此內(nèi)含子由于額外序列的存在而能被檢測出來,但最終的定義是通過比較序列而得出的比較不同生物的同源基因,我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子的位置通常是保守的,但是相應(yīng)的內(nèi)含子的長度變化可以很大內(nèi)含子通常不編碼蛋白質(zhì),比較珠蛋白的CDNA和基因組DNA的限制圖譜,我們發(fā)現(xiàn)基因有兩個內(nèi)含子而CDNA中則沒有在CDNA和基因組DNA中,外顯子限制圖譜的排列是一致的,內(nèi)含子就是包含在基因中但在MRNA中缺失的一段序列此處顯示的是CDNA序列讀框用交互開放和陰影區(qū)表示值得注意的是三個可能的讀框被內(nèi)含子中的終止密碼子所阻斷,所有功能性?珠蛋白基因都是三個外顯子的斷裂基因結(jié)構(gòu)圖中標(biāo)識的長度亦適用于哺乳動物?珠蛋白基因,25EXONSEQUENCESARECONSERVEDBUTINTRONSVARY外顯子序列保守而內(nèi)含子序列變化多端,比較不同物種的相關(guān)基因,我們發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的外顯子序列通常是保守的,而內(nèi)含子序列則很少保守編碼蛋白質(zhì)的序列通常處于選擇壓力之下,內(nèi)含子由于沒有選擇壓力,因此比外顯子的進(jìn)化快得多,小鼠?MAJ和?MIN珠蛋白基因在編碼區(qū)密切相關(guān),但在兩側(cè)區(qū)域和大的內(nèi)含子中則不同,26GENESCANBEISOLATEDBYTHECONSERVATIONOFEXONS通過外顯子的保守性可以分離基因,通過確定在多種生物中出現(xiàn)的片段來鑒定編碼區(qū)域,而外顯子的保守性可以作為這種鑒定的基礎(chǔ),外顯子捕捉技術(shù)中用到一種特殊的剪接載體如果基因組片段中含有一個外顯子,那么它的序列可以在細(xì)胞質(zhì)RNA中被發(fā)現(xiàn)但如果基因組片段中只由內(nèi)含子中的序列組成,那么剪接就不會發(fā)生,且MRNA中也不會運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中,27GENESSHOWAWIDEDISTRIBUTIONOFSIZES基因大小的變化范圍很大,酵母中大多數(shù)基因是非斷裂基因,但在高等生物中大多數(shù)基因是斷裂基因外顯子通常短小,典型的外顯子編碼不到100個氨基酸在低等真核生物中內(nèi)含子短小,但在高等真核生物中內(nèi)含子的長度變化范圍在幾十KB之間一條基因的總長度主要由它的內(nèi)含子所決定,酵母中大多數(shù)基因是非斷裂基因,但果蠅和哺乳動物中大多數(shù)是斷裂基因,酵母基因比較小,而果蠅和哺乳動物的基因大小的變化范圍廣,有的基因可以有很大的變化,編碼蛋白質(zhì)的外顯子通常很短,內(nèi)含子大小的變化范圍可以從很短到很長,28SOMEDNASEQUENCESCODEFORMORETHANONEPROTEIN一些DNA序列編碼一種以上的蛋白質(zhì),交替使用起始或終止密碼子可產(chǎn)生兩種蛋白質(zhì),其中一種蛋白質(zhì)片段的結(jié)構(gòu)與另一種相當(dāng)當(dāng)兩條重疊基因使用不同讀框翻譯時,非同源的蛋白質(zhì)序列可以由相同的DNA序列翻譯得到,差異可變剪接方式可包含或去除一定的外顯子,從而產(chǎn)生在一定區(qū)域出現(xiàn)或缺失的同源蛋白質(zhì),這可以采用包含或去除一些外顯子或在兩個外顯子中選擇其一的方式而實(shí)現(xiàn),通過在不同的起始位點(diǎn)起始表達(dá)或在不同的終止位點(diǎn)終止表達(dá),一條基因可以翻譯出兩種不同的蛋白質(zhì),通過使用不同的讀框,兩條基因可共享一段DNA序列,可變剪接產(chǎn)生肌鈣蛋白T的?和?兩種類型,可變剪接使用相同的前體MRNA,產(chǎn)生的MRNA含有不同的外顯子組合,212ISALLGENETICINFORMATIONCONTAINEDINDNA所有的遺傳信息都包含在DNA中嗎,基因的定義已經(jīng)從“一條基因，一種蛋白質(zhì)”修改成“一種蛋白質(zhì)，一條基因”在發(fā)育中，位置信息也很重要．,復(fù)習(xí)題,什么是外顯子與內(nèi)含子什么是差異剪接,

簡介：CHAPTER15,RECOMBINATIONANDREPAIR重組與修復(fù),151INTRODUCTION引言,同源重組（HOMOLOGOUSRECOMBINATION）涉及兩條攜帶同樣遺傳位點(diǎn)的染色體間的DNA序列交換。位點(diǎn)特異性重組（SITESPECIFICRECOMBINATION）發(fā)生在兩個特異序列之間。轉(zhuǎn)座（TRANSPOSITION）指的是轉(zhuǎn)座子移到基因組的新位點(diǎn)。拷貝選擇（COPYCHOICE）是一種RNA病毒使用的重組。,同源重組可能發(fā)生在兩條同源DNA的任意位點(diǎn)上,位點(diǎn)專一性重組發(fā)生在兩條特定的序列綠色,兩條重組DNA的其他序列則是不同源的,位點(diǎn)專一性重組能使二聚體環(huán)狀DNA分子產(chǎn)生兩個單體環(huán)狀DNA分子,152HOMOLOGOUSRECOMBINATIONOCCURSBETWEENSYNAPSEDCHROMOSOMES聯(lián)會染色體之間的同源重組,染色體必須聯(lián)會形成交叉才能使同源染色體發(fā)生交換減數(shù)分裂的不同階段與發(fā)生于DNA上的分子事件密切相關(guān),重組發(fā)生在第一個減數(shù)分裂的前期盡管復(fù)制狀態(tài)只在末期變得可見,但染色體的出現(xiàn)也標(biāo)志著前期的開始,這時每條染色體含兩份拷貝姐妹染色體,并且任何交換事件的分子水平的相互作用僅發(fā)生在4條染色體中的兩條,細(xì)線期,偶線期,粗線期,雙線期,終變期,153BREAKAGEANDREUNIONINVOLVESHETERODUPLEXDNA斷裂與重連涉及異源雙鏈體DNA,兩條雙鏈體DNA分子間的重組關(guān)鍵是單鏈的交換當(dāng)雙鏈體DNA的單鏈與相對應(yīng)的另一雙鏈體中的單鏈發(fā)生置換時,會產(chǎn)生一個分叉結(jié)構(gòu)交換產(chǎn)生異源雙鏈體DNA片段,兩條單鏈分別來自父本和母本,聯(lián)合分子可以通過切開相接的鏈從而形成兩條分開的雙鏈體分子重組體是否形成取決于參與原來交換的鏈,或另一對鏈在解離過程中是否被切開,兩條配對雙鏈體DNA的重組包括相互的單鏈交換,分叉遷移和缺口的切出,根據(jù)鏈被切出缺口的位置,HOLLIDAY結(jié)構(gòu)的結(jié)果可產(chǎn)生親本雙鏈體或重組雙鏈體兩種類型的產(chǎn)物都有一段異源雙鏈體DNA,154DOUBLESTRANDBREAKSINITIATERECOMBINATION雙鏈斷裂引發(fā)重組,DNA受體雙鏈體的雙鏈斷裂引發(fā)重組核酸外切酶作用產(chǎn)生3單鏈末端,它能進(jìn)一步攻擊其他供體雙鏈體新合成的DNA代替被降解的物質(zhì)這產(chǎn)生一個重組的聯(lián)合分子,其中兩個DNA雙鏈體由異源雙鏈體DNA連接而成,重組由雙鏈斷裂啟動,然后產(chǎn)生3?單鏈末端,其中的一個移到同源雙鏈體上,158THEBACTERIALRECBCDSYSTEMISSTIMULATEDBYCHISEQUENCESCHI位點(diǎn)激活細(xì)菌的RECBCD系統(tǒng),RECBCD復(fù)合體有核酸酶與解旋酶的活性它結(jié)合到DNA的CHI位點(diǎn)下游,解開雙鏈體,從3?端到5?端降解一條鏈直到CHI位點(diǎn)為止CHI位點(diǎn)引發(fā)RECD亞基的丟失以及核酸酶活性,RECBCD核酸酶從一邊開始向CHI位點(diǎn)前進(jìn),當(dāng)它前進(jìn)時，它降解DNA；在CHI位點(diǎn)，它進(jìn)行核酸酶內(nèi)切,而后失去RECD,并只保留解旋酶活性,159STRANDTRANSFERPROTEINSCATALYZESINGLESTRANDASSIMILATION鏈轉(zhuǎn)移蛋白催化單鏈同化,RECA與單鏈或雙鏈DNA形成微絲,催化含3端游離的單鏈DNA與DNA雙鏈體上的對應(yīng)區(qū)段發(fā)生置換,在部分雙鏈體分子和完整雙鏈體DNA分子之間,RECA介導(dǎo)鏈的交換,它產(chǎn)生了與重組中間體的結(jié)構(gòu)一樣的聯(lián)合分子,1510THERUVSYSTEMRESOLVESHOLLIDAYJUNCTIONSRUV系統(tǒng)解開HOLLIDAY連接點(diǎn),RUV復(fù)合體作用于重組接點(diǎn)RUVA識別重組接點(diǎn),而RUVB是一個催化分叉遷移的解旋酶RUVC切割重組接點(diǎn),產(chǎn)生重組中間體,1516SPECIALIZEDRECOMBINATIONINVOLVESSPECIFICSITES專一性重組涉及特異位點(diǎn),專一性重組在特異位點(diǎn)進(jìn)行,但位點(diǎn)不一定是同源的?噬菌體通過噬菌體位點(diǎn)和大腸桿菌染色體上ATT位點(diǎn)的重組整合到細(xì)菌染色體上通過線性前噬菌體末端位點(diǎn)之間的重組使得噬菌體從細(xì)菌染色體上外切出來?噬菌體的INT編碼整合酶來催化整合反應(yīng),通過在ATTB和ATTP之間的相互重組,噬菌體環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變成線性的前噬菌體而通過在ATTL和ATTR之間的相互重組,前噬菌體能被外切出來,1517SITESPECIFICRECOMBINATIONINVOLVESBREAKAGEANDREUNION位點(diǎn)專一性重組涉及斷裂和重連,ATTB和ATTP產(chǎn)生7個BP交錯的切口,末端以十字架狀連接,ATTB和ATTP的共同核心序列的交叉切割允許十字架狀的連接,使相互之間能產(chǎn)生重組連接點(diǎn),1519LAMBDARECOMBINATIONOCCURSINANINTASOME?噬菌體重組發(fā)生在整合體中,?噬菌體整合發(fā)生在一個包含宿主蛋白IHF的大復(fù)合體中切割反應(yīng)需要INT和XIS,并且需識別前噬菌體DNA末端作為底物,INT和XIS結(jié)合到ATTP的不同位點(diǎn),在核心區(qū)域的INT識別位點(diǎn)包括被切割位點(diǎn),,CRERECOMBINASE,P1PHAGE,1520REPAIRSYSTEMSCORRECTDAMAGETODNA修復(fù)系統(tǒng)校正DNA損傷,修復(fù)系統(tǒng)識別與標(biāo)準(zhǔn)堿基對不一致的DNA序列外切系統(tǒng)把DNA鏈從損傷位點(diǎn)移去,然后替換它重組修復(fù)系統(tǒng)利用重組來替換損傷的雙鏈體區(qū)域所有這些系統(tǒng)在修復(fù)過程中易于引入錯誤光激活是一種非突變性修復(fù)系統(tǒng),特異性地作用于嘧啶二聚體,胞嘧啶脫氨形成UG堿基配對,尿嘧啶將優(yōu)先從錯配堿基中去除,復(fù)制錯誤產(chǎn)生錯配堿基對,通過代替一個堿基,這個錯配堿基對就能被校正如果不能被校正,那么突變就會存在于子代雙鏈體中,紫外線照射在兩個相鄰胸腺嘧啶之間形成二聚體,它抑制復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,堿基的甲基化扭曲了雙鏈螺旋結(jié)構(gòu),引起復(fù)制時的錯配,去嘌呤化將堿基從DNA中去除,修復(fù)基因可被歸為不同的通路,它們分別運(yùn)用不同的機(jī)制逆轉(zhuǎn)或繞過DNA損傷,補(bǔ)充大腸桿菌中的堿基切除修復(fù)系統(tǒng),利用合適的糖基化酶去除不正確的堿基,產(chǎn)生一個無堿基位點(diǎn)AP位點(diǎn)AP內(nèi)切酶在AP位點(diǎn)上游切割受損DNA,這樣形成一個靠近AP位點(diǎn)的3‘OH端DNA聚合酶延伸3‘OH端,同時切除AP位點(diǎn),大腸桿菌中的堿基切除修復(fù),1521EXCISIONREPAIRSYSTEMSINECOLINUCLEOTIDEEXCISIONREPAIR大腸桿菌中的外切修復(fù)系統(tǒng)核苷酸切除修復(fù),UVR系統(tǒng)在距離損傷DNA兩側(cè)約12BP處插入,移去插入點(diǎn)之間的DNA序列,并重新合成新的DNA,外切修復(fù)系統(tǒng)去除和替代一段含有損傷堿基的DNA,UVR系統(tǒng)作用的不同階段,UVRAB復(fù)合物識別損傷部位UVRBC復(fù)合物切開一個缺口UVRD解開標(biāo)記的區(qū)域,1524ERRORPRONEREPAIRANDMUTATORPHENOTYPES錯誤傾向性修復(fù)和增變體表型,若損傷DNA未被修復(fù)會導(dǎo)致DNA聚合酶III在復(fù)制過程中停止DNA聚合酶V或DNA聚合酶IV能夠合成一條損傷鏈的補(bǔ)償鏈修復(fù)性DNA聚合酶合成的DNA常常含有錯誤序列,1525CONTROLLINGTHEDIRECTIONOFMISMATCHREPAIR控制錯配修復(fù)的方向,MUT基因編碼處理錯配堿基對的錯配修復(fù)系統(tǒng)選擇哪一條鏈進(jìn)行修復(fù)是有傾向性的在半甲基化的處,缺少甲基化的鏈常常被置換這用于切除新合成鏈中的錯誤,GATCCTAG,在復(fù)制后,GATC序列是DAM甲基化酶的靶標(biāo),非甲基化鏈?zhǔn)清e配堿基修復(fù)的靶標(biāo),MUTS識別錯配堿基,并轉(zhuǎn)位到GATC序列在GATC序列,MUTH切割未甲基化的鏈,最后,核酸內(nèi)切酶切除GATC位點(diǎn)到錯配位點(diǎn)間的片段,1526RECOMBINATIONREPAIRSYSTEMSINECOLI大腸桿菌中的重組修復(fù)系統(tǒng),大腸桿菌的REC基因編碼主要的重組修復(fù)系統(tǒng)復(fù)制在新合成鏈中留下一個對應(yīng)于損傷序列的缺口時,此系統(tǒng)起作用另一條雙鏈體中的單鏈被用來置換缺口然后損傷的序列被切除并重新合成,如果此鏈有無法修補(bǔ)的損傷位點(diǎn),大腸桿菌修補(bǔ)系統(tǒng)將會用正常的DNA鏈替代留在新合成鏈中的間隙,1528RECATRIGGERSTHESOSSYSTEMRECA引發(fā)SOS系統(tǒng),DNA損傷導(dǎo)致RECA引發(fā)SOS應(yīng)答途徑,這條途徑由許多編碼修復(fù)酶的基因組成RECA能激活LEXA的自我切割活性LEXA抑制SOS系統(tǒng)它的自我切割激活那些基因,LEXA蛋白能抑制許多基因的表達(dá),包括起修復(fù)作用的RECA和LEXA,RECA的激活引起LEXA的蛋白水解,從而誘導(dǎo)所有的這些基因,1530ACOMMONSYSTEMREPAIRSDOUBLESTRANDBREAKS一種常見的修復(fù)斷裂雙鏈的系統(tǒng),NHEJ途徑可以連接雙鏈體DNA的鈍性末端NHEJ途徑的突變導(dǎo)致人類疾病,非同源末端連接需要識別斷裂末端,突出末端的修復(fù)和或填充,最后被連接在一起,復(fù)習(xí)題,同源重組的雙鏈斷裂模型大腸桿菌的外切修復(fù)系統(tǒng),

簡介：第七章現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),（3）,第一節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第二節(jié)物理圖譜的構(gòu)建第三節(jié)基因組測序技術(shù)第四節(jié)分子標(biāo)記技術(shù)第五節(jié)基因表達(dá)研究技術(shù)第六節(jié)DNA蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù),第三節(jié)分子標(biāo)記技術(shù),一、遺傳圖譜GENETICMAP,遺傳圖譜GENETICMAP又稱遺傳連鎖圖譜或連鎖圖譜LINKAGEMAP。經(jīng)典遺傳學(xué)時代的遺傳連鎖圖譜主要是以家系分析或不同性狀個體間雜交為基礎(chǔ)，根據(jù)同源染色體上等位基因的變化，通過計(jì)算重組率，確定染色體上基因座位的順序和距離，構(gòu)建基因的連鎖圖譜。,經(jīng)典遺傳圖譜,人們把單倍體配子所有染色體上的全部基因稱為一個基因組。基因組內(nèi)每條染色體上的連鎖基因稱為一個連鎖群。繪制遺傳圖譜就是要進(jìn)行每條染色體上基因座位的順序和距離的確定，即主要通過家系分析，對不同性狀之間、性狀與標(biāo)記之間、標(biāo)記與標(biāo)記之間的連鎖遺傳頻率進(jìn)行計(jì)算，最終繪制遺傳連鎖圖。人類遺傳圖譜包括女性一種配子的23條染色體記作23，X和男性兩種配子的23條染色體23，X、23，Y上的所有基因位點(diǎn)。,現(xiàn)代遺傳圖譜,70年代發(fā)展起來的DNA重組技術(shù)、DNA克隆技術(shù)和DNA探針技術(shù)無疑為拓展遺傳圖譜的構(gòu)建途徑創(chuàng)造了技術(shù)條件，也使人類基因定位的方法從細(xì)胞及染色體水平過渡到分子水平。DNA水平的多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)作為繪制現(xiàn)代遺傳圖譜的主要界標(biāo)，大大提高圖譜的精確度、準(zhǔn)確性。遺傳圖譜的繪制也因此進(jìn)入了一個嶄新的時代?，F(xiàn)代遺傳圖譜的概念是由BOTSTEIND等1980首先提出的，在此基礎(chǔ)上，限制性片段長度多態(tài)性RFLP作為遺傳圖譜的第一代嶄新標(biāo)記得以問世。遺傳圖譜的第二代標(biāo)記位點(diǎn)是大量的可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)（VNTR，包括微、小衛(wèi)星MS或短串聯(lián)重復(fù)STR或SSLP。第三代標(biāo)記是位點(diǎn)極其豐富的單核苷酸多態(tài)性SNP。,二、分子標(biāo)記的概念,廣義的分子標(biāo)記MOLECULARMARKER是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶（指由一個以上基因位點(diǎn)編碼的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位點(diǎn)的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式）。狹義的分子標(biāo)記概念只是指DNA標(biāo)記，而這個界定現(xiàn)在被廣泛采納能反映生物個體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，它直接反映基因組DNA間的差異。,三、分子標(biāo)記的種類,分子標(biāo)記大多以電泳譜帶的形式表現(xiàn)，大致可分為三大類。第一類是以分子雜交為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，包括★限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記（RESTRICTIONFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM,簡稱RFLP標(biāo)記）；★DNA指紋技術(shù)（DNAFINGERPRINTING）；★原位雜交（INSITUHYBRIDIZATION）等；,第二類是以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（POLYMERASECHAINREACTION,簡稱PCR反應(yīng)）為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，包括★★隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RANDOMAMPLIFICATIONPOLYMORPHISMDNA,簡稱RAPD標(biāo)記）；★★簡單序列重復(fù)標(biāo)記（SIMPLESEQUENCEREPEAT,簡稱SSR標(biāo)記）或簡單序列長度多態(tài)性（SIMPLESEQUENCELENGTHPOLYMORPHISM,簡稱SSLP標(biāo)記）；★★擴(kuò)展片段長度多態(tài)性標(biāo)記（AMPLIFIEDFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM,簡稱AFLP標(biāo)記）；★★序標(biāo)位（SEQUENCETAGGEDSITES,簡稱STS標(biāo)記）；★★序列特征化擴(kuò)增區(qū)域（SEQUENCECHARACTEREDAMPLIFIEDREGION,簡稱SCAR標(biāo)記）等；,第三類是一些新型的分子標(biāo)記，如★★單核苷酸多態(tài)性（SINGLENULEOTIDEPOLYMORPHISM,簡稱SNP標(biāo)記）；★★表達(dá)序列標(biāo)簽（EXPRESSEDSEQUENCESTAGS,簡稱EST標(biāo)記）等。,四、分子標(biāo)記的特點(diǎn),（1）直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個組織、各個發(fā)育階段均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否等問題；（2）數(shù)量極多，遍布整個基因組，可檢測座位幾乎無限；（3）多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無須人為創(chuàng)造；（4）表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)；（5）許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性的特點(diǎn)，能區(qū)別純合體和雜合體。,五、幾種常用的分子標(biāo)記,（一）限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記（RESTRICTIONFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM,RFLP）該技術(shù)由GRODZICKER等于1974年創(chuàng)立。特定生物類型的基因組DNA經(jīng)某一種限制性內(nèi)切酶完全酶解后，會產(chǎn)生分子量不同的同源等位片段，或稱限制性等位片段。RFLP標(biāo)記技術(shù)的基本原理就是通過電泳的方法分離和檢測這些片段。凡是可以引起酶解位點(diǎn)變異的突變，如點(diǎn)突變（新產(chǎn)生和去除酶切位點(diǎn)）和一段DNA的重新組織（如插入和缺失造成酶切位點(diǎn)間的長度發(fā)生變化）等均可導(dǎo)致限制性等位片段的變化，從而產(chǎn)生RFLP。,ECORⅠ酶切示意圖,5’AGGAATTCGAATTCGAATTCCG3’3’TCCTTAAGCTTAAGCTTAAGGC5’AGGAATTCGAATTCGAATTCCGTCCTTAAGCTTAAGCTTAAGGC5’AGGAATTCGAATCCGAATTCCG3’3’TCCTTAAGCTTAGGCTTAAGGC5’AGGAATTCGAATCCGAATTCCGTCCTTAAGCTTAGGCTTAAGCG,基本步驟DNA提取→用DNA限制性內(nèi)切酶消化→凝膠電泳分離限制性片段→將這些片段按原來的順序和位置轉(zhuǎn)移到易操作的濾膜上→用放射性同位素或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的DNA作探針與膜上的DNA雜交（稱SOUTHERN雜交）→放射性自顯影或酶學(xué)檢測顯示出不同材料對該探針的限制性酶切片段多態(tài)性。,RFLP標(biāo)記的主要特點(diǎn)有（1）遍布于整個基因組，數(shù)量幾乎是無限的；（2）無表型效應(yīng)，不受發(fā)育階段及器官特異性限制；（3）共顯性，可區(qū)分純合子和雜合子；（4）結(jié)果穩(wěn)定、可靠；（5）DNA需要量大，檢測技術(shù)繁雜，難以用于大規(guī)模的育種實(shí)踐中。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,A,B,A,B,限制性內(nèi)切酶位點(diǎn),與放射性探針結(jié)合部位,①限制性內(nèi)切酶酶切后；②電泳分離DNA片段；③轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜；④與放射性探針雜交，⑤分析陽性條帶,（二）染色體原位雜交,染色體原位雜交技術(shù)是DNA探針與染色體上的DNA雜交，并在染色體上直接進(jìn)行檢測的分子標(biāo)記技術(shù)。目前發(fā)展最快的是熒光素標(biāo)記的原位DNA雜交技術(shù)，即熒光原位雜交技術(shù)（FLUORESCENCEINSITUHYBRIDIZATION,簡稱FISH技術(shù)），是利用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與抗原標(biāo)記的探針分子特異性的結(jié)合來檢測DNA序列在染色體上的位置。,熒光標(biāo)記原位雜交原理示意圖,原位雜交技術(shù)的基本步驟為,制備探針；染色體制片；染色體處理與變性；染色體與探針雜交；顯微檢測。,染色體專一位點(diǎn)探針,,熒光標(biāo)記探針檢測精子,（三）隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記RAPD,由WILLIAMS等于1990年創(chuàng)立。其基本原理與PCR技術(shù)一致。RAPD標(biāo)記技術(shù)就是用一個（有時用兩個）隨機(jī)引物（一般810個堿基）非定點(diǎn)地?cái)U(kuò)增基因組DNA，然后用凝膠電泳分開擴(kuò)增片段。遺傳材料的基因組DNA如果在特定引物結(jié)合區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變，就有可能導(dǎo)致引物結(jié)合位點(diǎn)的分布發(fā)生相應(yīng)的變化，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量變化。若PCR產(chǎn)物增加或缺少，則產(chǎn)生RAPD標(biāo)記。,親本中國春小麥、節(jié)節(jié)麥雙倍體和子代的RAPD電泳圖譜,引物為S516CTCTGCGCGT泳道1為中國春小麥，泳道2、二者的子代，泳道3為節(jié)節(jié)麥。,RAPD擴(kuò)增克隆魚B、供體紅鯉A、受體金魚D和雜交魚C，即A♂XD♀的細(xì)胞核DNA指紋圖譜。結(jié)果顯示，對于不同的引物，克隆魚的擴(kuò)增譜帶均和供體紅鯉的一致，迥異于受體金魚和雜交魚。,RAPD標(biāo)記的主要特點(diǎn)有（1）不需DNA探針，設(shè)計(jì)引物也無須知道序列信息；（2）顯性遺傳（極少數(shù)共顯性），不能鑒別雜合子和純合子；（3）技術(shù)簡便，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術(shù)；（4）DNA樣品需要量少，引物價格便宜，成本較低；（5）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差，結(jié)果可靠性較低。,（四）簡單序列重復(fù)標(biāo)記，SSR,又稱微衛(wèi)星DNAMICROSATELLITEDNA標(biāo)記；屬高度重復(fù)序列，重復(fù)單元26BP，如CAN、AT、GGCN等重復(fù)，重復(fù)區(qū)大多幾十幾百BP，分散在基因組中，大多不存在于編碼序列內(nèi)，具有較高的多態(tài)性。呈現(xiàn)孟德爾式遺傳。目前微衛(wèi)星DNA已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了２萬余個位點(diǎn)。,TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG,,,,,,微衛(wèi)星DNAPCR擴(kuò)增結(jié)果（示例）,500BP400BP300BP240BP,該結(jié)果顯示在所檢查的人群中，該位點(diǎn)多態(tài)性有4種。,,SSR標(biāo)記的主要特點(diǎn),（1）數(shù)量豐富，廣泛分布于整個基因組；（2）具有較多的等位性變異；（3）共顯性標(biāo)記，可鑒別出雜合子和純合子；（4）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果可靠；（5）由于創(chuàng)建新的標(biāo)記時需知道重復(fù)序列兩端的序列信息，因此其開發(fā)有一定困難，費(fèi)用也較高。,（五）單核苷酸多態(tài)性SINGLENUCLEOTIDEPOLYMORPHISMSNP,1定義單核苷酸多態(tài)性SNP主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。不同個體間，基因組DNA某部位的單核苷酸的變異。1996年，LANDER報(bào)道了用單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（SINGLENUCLEOTIDPOLYMORPHISMSNP）制備第三代遺傳連鎖圖的遺傳標(biāo)記。,2SNP在人類基因組中出現(xiàn)的頻率,SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)1700萬個甚至更多。THEREISONESNPINEVERY1000BASESLEADSTOANESTIMATETHATANYTWOINDIVIDUALSDIFFERBYUPTOTHREEMILLIONSNPS在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上?？偟膩碚f，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNPCODINGSNP,CSNP比較少，因?yàn)樵谕怙@子內(nèi)，其變異率僅及周圍序列的1/5。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此CSNP的研究更受關(guān)注。,3SNP檢測方法,目前已有多種方法可用于SNP檢測★根據(jù)DNA列陣的微測序法；★動態(tài)等位基因特異的雜交；★寡聚核苷酸特異的連接；★DNA芯片以及TAQMAN系統(tǒng)等。但不管哪一種方法，首先必須進(jìn)行靶序列的擴(kuò)增，然后才能進(jìn)行其它檢測。,4SNP用作遺傳標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn),1SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因頻率都可估計(jì)出來。2它在基因組中的分布較微衛(wèi)星標(biāo)記廣泛得多。3與串聯(lián)重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)相比，SNP是高度穩(wěn)定的，尤其是處于編碼區(qū)的SNPCSNP,而前者的高突變率容易引起對人群的遺傳分析出現(xiàn)困難。4部分位于基因內(nèi)部的SNP可能會直接影響產(chǎn)物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或基因表達(dá)水平，因此，它們本身可能就是疾病遺傳機(jī)制的候選改變位點(diǎn)。5易于進(jìn)行自動化分析，縮短了研究時間。,5SNP的意義,對于人類來說，SNP的意義在于１、致病SNP２、疾病易感性SNP３、具有診斷價值的SNP４、疾病的SNP譜５、人表型相關(guān)SNP６、藥物作用與不良反應(yīng)的SNP７、藥物劑量SNP,日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)糖尿病基因的個人SNP差別,日本研究人員最近經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，與糖尿病有關(guān)的基因并不是千篇一律，它們之間存在著個人差別，即“單核苷酸多態(tài)性”（SNP）。,,預(yù)計(jì)今后SNP將在下列領(lǐng)域發(fā)揮重要作用1進(jìn)行簡單和復(fù)雜疾病的遺傳連鎖分析LINKAGEANALYSIS及關(guān)聯(lián)分析ASSOCIATIONANALYSIS,用于疾病易感基因定位；而且其定位的精度將比微衛(wèi)星標(biāo)記精細(xì)得多，可直接用于指導(dǎo)易感基因克隆。2在“藥物基因組學(xué)”PHARMACOGENOMICS研究中，可通過檢測SNP的遺傳多態(tài)性標(biāo)記揭示人群中不同個體對不同藥物的敏感性差異的根本原因。3也可用于法醫(yī)研究的罪犯身份的鑒別、親子鑒定等，此外在器官移植中供體和受體間的配對選擇及物種進(jìn)化的研究中都將具有重要意義。,分子標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用,分子遺傳圖譜的構(gòu)建遺傳多樣性與種質(zhì)鑒定重要農(nóng)藝性狀相關(guān)基因的定位分子標(biāo)記輔助選擇重要農(nóng)藝性狀的圖位克隆,,瀏覽以下網(wǎng)站國內(nèi)天大生物信息中心HTTP//TUBICTJUEDUCN北大生物信息中心HTTP//CBIPKUEDUCN中國生物信息HTTP//WWWBIOSINOORG/國外美國國家生物技術(shù)信息中心NCBIHTTP//NCBINLMNIHGOV歐洲生物信息學(xué)研究所EBIHTTP//WWWEBIACUK,HTTP//WWWSDSYNET/SW/03HTM,SNP在“藥物基因組學(xué)”PHARMACOGENOMICS研究中應(yīng)用,不同個體的藥物反應(yīng)（主要指藥效與毒性）差異與DNA多態(tài)性的關(guān)系。即通過DNA序列差異的分析，從基因水平上深入認(rèn)識疾病及藥物作用的個體差異的機(jī)理，指導(dǎo)和優(yōu)化臨床用藥。并有可能在此基礎(chǔ)上發(fā)展個體化醫(yī)療,SNPSAFFECTINGDRUGEFFECTS,POLYMORPHISMSINENZYMESTHATMETABOLIZEDRUGSARERESPONSIBLEFORUNEXPECTEDTOXICITYAFTERADMINISTRATIONOFANORMALDRUGDOSESNPSINTHECODINGREGIONSOFGENESOFTHEENZYMESNECESSARYFORTHEBIOTRANSFORMATIONOFENDOGENOUSANDEXOGENOUSCOMPOUNDSCANDECREASEOREVENPREVENTDRUGMETABOLISM,CYTOCHROMEP450,細(xì)胞色素Ｐ450CYP同功酶是藥物代謝酶并顯示了基因多態(tài)性。人體內(nèi)有六種不同的細(xì)胞色素Ｐ450CYP1A2,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1和CYP3A4負(fù)責(zé)清理體內(nèi)藥物。CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6的多態(tài)性與個體間差異有很大關(guān)聯(lián)性。如果有人缺失這種酶,常常被稱為‘差的’或‘慢的’藥物代謝體ＰＭPOORMETABOLIZER,這種人有較大的高藥物濃度中毒的可能性如果有高活性或過量的這些酶,就被稱為‘快速的’代謝體,這種人對藥物治療可能有抗性。,,

簡介：生物化學(xué)與分子生物學(xué),授課教師郝軍莉EMAILHAOJUNLI00163COM,1蛋白質(zhì)2核酸3遺傳信息的傳遞表達(dá)4酶5糖代謝6脂代謝7蛋白質(zhì)代謝8氨基酸代謝9核苷酸代謝10維生素,第一章生物大分子蛋白質(zhì),要點(diǎn)１氨基酸的通式及分類２肽鍵的形成３蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)及空間結(jié)構(gòu)的關(guān)系４變性的本質(zhì)及應(yīng)用,蛋白質(zhì)的定義及元素組成,定義蛋白質(zhì)PROTEIN是由許多氨基酸AMINOACIDS通過肽鍵PEPTIDEBOND相連形成的高分子含氮化合物。組成元素主要有C、H、O、N和S還含有少量的P、FE、CU、ZN、MN、CO、MO、I,氨基酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),（1）蛋白質(zhì)水解所得的氨基酸為Α氨基酸（脯氨酸為Α亞氨酸）（2）組成天然蛋白質(zhì)的氨基酸均為L型（甘氨酸除外）存在自然界中的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸僅有20種，且均屬L氨基酸（甘氨酸除外）。,,,幾種特殊氨基酸,脯氨酸（亞氨基酸）,亞氨基酸分子中不含有氨基（NH2），而是含有亞氨基NH和羧基,注意點(diǎn)①為亞氨基酸，此氨基仍能與另一羧基形成肽鍵②亞氨基的N在環(huán)中，移動的自由度受限制，當(dāng)脯氨酸處于多肽鏈中時，往往形成轉(zhuǎn)角③可被修飾為羥脯氨酸,非極性脂肪族氨基酸極性中性氨基酸芳香族氨基酸酸性氨基酸堿性氨基酸,氨基酸可根據(jù)側(cè)鏈結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進(jìn)行分類,肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。,兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽,肽鏈中的氨基酸分子因?yàn)槊撍s合而基團(tuán)不全，被稱為氨基酸殘基RESIDUE。,由十個以內(nèi)氨基酸相連而成的肽稱為寡肽OLIGOPEPTIDE，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽POLYPEPTIDE。,肽的相關(guān)概念,谷胱甘肽存在于身體的幾乎每一個細(xì)胞，解毒，抗衰老，爭搶免疫力等功能,,,蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)包括,一級結(jié)構(gòu)PRIMARYSTRUCTURE二級結(jié)構(gòu)SECONDARYSTRUCTURE三級結(jié)構(gòu)TERTIARYSTRUCTURE四級結(jié)構(gòu)QUATERNARYSTRUCTURE,蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu),1、概念蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指在蛋白質(zhì)分子從N端至C端的氨基酸排列順序。2、主要結(jié)構(gòu)鍵肽鍵部分蛋白質(zhì)含有二硫鍵,一級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，但不是決定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的唯一因素。,二級結(jié)構(gòu)多肽鏈的局部主鏈構(gòu)象為蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu),1、Α螺旋2、Β折疊3、Β轉(zhuǎn)角4、無規(guī)線卷曲,（一）Α螺旋,概念多肽鏈中肽鍵平面通過Α碳原子的相對旋轉(zhuǎn)，沿長軸方向，按規(guī)律盤繞形成的緊密螺旋盤曲構(gòu)象。,（二）?折疊使多肽鏈形成片層結(jié)構(gòu),（三）?轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲在蛋白質(zhì)分子中普遍存在,?轉(zhuǎn)角,無規(guī)卷曲是用來闡述沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結(jié)構(gòu)。,三級結(jié)構(gòu),概念整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置，也就是整條肽鏈的所有原子在三維空間的排布位置。,亞基之間的結(jié)合主要是氫鍵和離子鍵。,四級結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。,有些蛋白質(zhì)分子含有二條或多條多肽鏈，每一條多肽鏈都有完整的三級結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)的亞基SUBUNIT。,血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性,變性概念在某些物理因素或化學(xué)因素的作用下維持蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)的次級鍵斷裂，天然構(gòu)象被破壞從而引起理化性質(zhì)的改變，生物學(xué)活性喪失的現(xiàn)象。變性本質(zhì)是空間結(jié)構(gòu)的破壞,復(fù)性若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為復(fù)性RENATURATION。,天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、Β巰基乙醇,,去除尿素、Β巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無活性,,蛋白質(zhì)的復(fù)性和變性,變性劑,變性的應(yīng)用,①臨床上用煮沸，高壓蒸汽，乙醇，紫外線等使細(xì)菌蛋白質(zhì)變性，達(dá)到滅菌的作用。②低溫保護(hù)可延緩生物活性蛋白質(zhì)變性,蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)THEPHYSICALANDCHEMICALCHARACTERSOFPROTEIN,一、蛋白質(zhì)具有兩性電離的性質(zhì),蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液PH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一PH時，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的PH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。,蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)ISOELECTRICPOINT,PI,二、蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì),蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達(dá)1～100NM，為膠粒范圍之內(nèi)。,顆粒表面電荷水化膜,蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素,三、蛋白質(zhì)在紫外光譜區(qū)有特征性吸收峰,由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280NM波長處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測定。,蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應(yīng)。,蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)，雙縮脲反應(yīng)可用來檢測蛋白質(zhì)水解程度。,四、應(yīng)用蛋白質(zhì)呈色反應(yīng)可測定蛋白質(zhì)溶液含量,茚三酮反應(yīng)NINHYDRINREACTION,雙縮脲反應(yīng)BIURETREACTION,第二章核酸的結(jié)構(gòu)和功能,STRUCTUREANDFUNCTIONOFNUCLEICACID,核酸的分類及分布,核酸的化學(xué)組成,1元素組成C、H、O、N、P（910）,,核酸組成,構(gòu)成核酸的基本單位,堿基BASE是含氮的雜環(huán)化合物。,堿基,,嘌呤,嘧啶,,,腺嘌呤,鳥嘌呤,尿嘧啶,胸腺嘧啶,胞嘧啶,,存在于DNA和RNA中,僅存在于RNA中,僅存在于DNA中,,,堿基,體內(nèi)重要的游離核苷酸及其衍生物,多磷酸核苷酸NMP，NDP，NTP,環(huán)化核苷酸CAMP，CGMP細(xì)胞信號傳導(dǎo)的第二信使,二、核酸的一級結(jié)構(gòu),定義核酸中核苷酸的排列順序。由于核苷酸間的差異主要是堿基不同，所以也稱為堿基序列。,書寫方法,,5?PAPCPTPGPCPTOH3?,,5?ACTGCT3?,,,,,目錄,核酸的方向性5’3’,DNA的空間結(jié)構(gòu)又分為二級結(jié)構(gòu)SECONDARYSTRUCTURE和高級結(jié)構(gòu)。,DNA的空間結(jié)構(gòu)SPATIALSTRUCTURE,構(gòu)成DNA的所有原子在三維空間具有確定的相對位置關(guān)系。,一、DNA的二級結(jié)構(gòu)是雙螺旋結(jié)構(gòu),（一）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（WATSON,CRICK,1953）,DNA分子由兩條相互平行但走向相反的脫氧多核苷酸鏈組成。兩鏈以脫氧核糖磷酸為骨架，以右手螺旋方式繞同一公共軸盤。螺旋直徑為2NM，形成大溝MAJORGROOVE及小溝MINORGROOVE相間。,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（WATSON,CRICK,1953）,堿基垂直螺旋軸居雙螺旋內(nèi)側(cè)，與對側(cè)堿基形成氫鍵配對（互補(bǔ)配對形式ATG?C）。相鄰堿基平面距離034NM，螺旋一圈螺距34NM，一圈10對堿基。,,,,,目錄,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（WATSON,CRICK,1953）,氫鍵維持雙鏈橫向穩(wěn)定性，堿基堆積力維持雙鏈縱向穩(wěn)定性。,,,,,目錄,DNA二級結(jié)構(gòu)模型的總結(jié),1、DNA分子由兩條脫氧核糖核苷酸鏈組成，兩條鏈的走向呈反向平行2、DNA是右手螺旋結(jié)構(gòu)3、脫氧核糖磷酸骨架位于螺旋的外側(cè)；堿基位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，每個堿基均與對應(yīng)鏈上的堿基處于同一平面而以氫鍵（HYDROGENBOND）結(jié)合4、堿基互補(bǔ)原則Ａ＝Ｔ，Ｇ＝Ｃ5、堿基平面與雙螺旋的長軸垂直，糖環(huán)的平面則與長軸平行6、DNA分子兩條鏈間互補(bǔ)堿基的氫鍵維持雙螺旋結(jié)構(gòu)的橫向穩(wěn)定性，縱向則靠堿基平面間的疏水性堿基堆積力（BASESTACKINGFORCE）來維系7、雙螺旋結(jié)構(gòu)上存在著兩條凹溝，與脫氧核糖磷酸骨架平行。較深的溝稱為大溝（MAJORGROOVE），較淺的稱為小溝（MINORGROOVE）螺旋直徑為237NM，軸距354NM,二、DNA的高級結(jié)構(gòu)是超螺旋結(jié)構(gòu),超螺旋結(jié)構(gòu)SUPERHELIX或SUPERCOILDNA雙螺旋鏈再盤繞即形成超螺旋結(jié)構(gòu)。,正超螺旋POSITIVESUPERCOIL盤繞方向與DNA雙螺旋方同相同。,負(fù)超螺旋NEGATIVESUPERCOIL盤繞方向與DNA雙螺旋方向相反。,（一）原核生物DNA的高級結(jié)構(gòu)超螺旋,原核生物DNA多為環(huán)狀，以負(fù)超螺旋的形式存在，平均每200堿基就有一個超螺旋形成。,（二）DNA在真核生物細(xì)胞核內(nèi)的組裝,真核生物染色體由DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，其基本單位是核小體NUCLEOSOME。,核小體的組成DNA約200BP組蛋白H1H2A，H2BH3H4,DNA的基本功能是以基因的形式荷載遺傳信息，并作為基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的模板。它是生命遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個體生命活動的信息基礎(chǔ)。,基因從結(jié)構(gòu)上定義，是指DNA分子中的特定區(qū)段，其中的核苷酸排列順序決定了基因的功能。,三、DNA是遺傳信息的物質(zhì)基礎(chǔ),四、DNA的變性DENATURATION,定義在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程。,方法過量酸，堿，加熱，變性試劑如尿素、酰胺以及某些有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等。,變性后其它理化性質(zhì)變化,OD260增高粘度下降比旋度下降浮力密度升高酸堿滴定曲線改變生物活性喪失,,,,,目錄,TM變性是在一個相當(dāng)窄的溫度范圍內(nèi)完成，在這一范圍內(nèi)，紫外光吸收值達(dá)到最大值的50時的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱融解溫度MELTINGTEMPERATURE,TM。其大小與GC含量成正比。,,,,,目錄,STRUCTUREANDFUNCTIONOFRNA,RNA的結(jié)構(gòu)與功能,RNA與蛋白質(zhì)共同負(fù)責(zé)基因的表達(dá)和表達(dá)過程的調(diào)控。RNA通常以單鏈的形式存在，但有復(fù)雜的局部二級結(jié)構(gòu)或三級結(jié)構(gòu)。RNA比DNA小的多。RNA的種類、大小和結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)比DNA表現(xiàn)出多樣性。,一、MRNA的功能把DNA所攜帶的遺傳信息，按堿基互補(bǔ)配對原則，抄錄并傳送至核糖體，用以決定其合成蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序。,從AUG開始，每三個核苷酸為一組編碼了一個氨基酸，稱為三聯(lián)體密碼CODON。成熟的MRNA由氨基酸編碼區(qū)和非編碼區(qū)構(gòu)成。5?末端的帽子CAP結(jié)構(gòu)和3?末端的多聚A尾POLYATAIL結(jié)構(gòu)。,,成熟的真核生物MRNA,轉(zhuǎn)運(yùn)RNATRANSFERRNA,TRNA在蛋白質(zhì)合成過程中作為各種氨基酸的載體,將氨基酸轉(zhuǎn)呈給MRNA。由74～95核苷酸組成；占細(xì)胞總RNA的15；具有很好的穩(wěn)定性。,二、TRNA是蛋白質(zhì)合成中的氨基酸載體,TRNA具有局部的莖環(huán)STEMLOOP結(jié)構(gòu)或發(fā)卡HAIRPIN結(jié)構(gòu)。,,（二）TRNA具有莖環(huán)結(jié)構(gòu),TRNA的二級結(jié)構(gòu)三葉草形,氨基酸臂DHU環(huán)反密碼環(huán)TΨC環(huán)額外環(huán),,TRNA的倒L三級結(jié)構(gòu),TRNA的3?末端都是以CCA結(jié)尾。3?末端的A與氨基酸共價連結(jié)，TRNA成為了氨基酸的載體。不同的TRNA可以結(jié)合不同的氨基酸。,,（三）TRNA的3?末端連接氨基酸,TRNA的反密碼子環(huán)上有一個由三個核苷酸構(gòu)成的反密碼子ANTICODON。TRNA上的反密碼子依照堿基互補(bǔ)的原則識別MRNA上的密碼子。,,（四）TRNA的反密碼子識別MRNA的密碼子,核蛋白體RNARIBOSOMALRNA，RRNA是細(xì)胞內(nèi)含量最多的RNA80％。RRNA與核蛋白體蛋白結(jié)合組成核蛋白體RIBOSOME，為蛋白質(zhì)的合成提供場所。,五、以RRNA為組分的核蛋白體是蛋白質(zhì)合成的場所,核蛋白體的組成,遺傳信息的傳遞表達(dá),1、DNA的復(fù)制2、RNA的生物合成3、蛋白質(zhì)的生物合成,,,返回目錄,返回主頁,,,返回目錄,返回主頁,,,返回目錄,返回主頁,,,返回目錄,返回主頁,,,返回目錄,返回主頁,1條件,A酶,解旋酶,B能量,C模板,DNA兩條鏈,線粒體供能ATP為直接能量來源,D原料,四種脫氧核苷酸,,斷開氫鍵,DNA聚合酶,,磷酸二酯鍵,遵循堿基互補(bǔ)配對原則,,,返回目錄,返回主頁,,,返回目錄,返回主頁,,,返回目錄,返回主頁,,,返回目錄,返回主頁,,,返回目錄,返回主頁,,,返回目錄,返回主頁,,,返回目錄,返回主頁,,,返回目錄,返回主頁,,,返回目錄,返回主頁,,,返回目錄,返回主頁,,,返回目錄,返回主頁,,,返回目錄,返回主頁,,,返回目錄,返回主頁,,,返回目錄,返回主頁,,,返回目錄,返回主頁,DNA的復(fù)制（動畫）,,,,,,,滑動夾子,DNA解旋酶,DNA引物酶,DNA聚合酶,DNA聚合酶H,DNA連接酶,,,,,,,,,,,DNA解旋酶打開DNA雙鏈,引物酶合成引物（RNA），為復(fù)制準(zhǔn)備,,,,,,,,,,,,,,,,,A,,,,,,,,,,,,DNA聚合酶合成DNA片段,,,,,A,,,,,,,,,,,,,后隨鏈繼續(xù)合成新的引物，然后合成新的片段,,,,,,,A,,,,,,,,,,,,,,,,DNA聚合酶H切除引物片段，并填補(bǔ)缺口，留下一個小缺口（紅色區(qū)域）,,,,A,,,,,,,,,,,,,,,,,DNA連接酶填補(bǔ)小缺口,,,,A,,,,,,,,,,,,,,,解旋酶脫下，DNA復(fù)制完成,,,返回目錄,返回主頁,DNA復(fù)制特征,1半保留復(fù)制2半不連續(xù)復(fù)制3DNA復(fù)制具有高度的忠實(shí)性和準(zhǔn)確性4邊解旋邊復(fù)制5DNA復(fù)制從起始點(diǎn)開始雙向進(jìn)行6DNA復(fù)制時模板方向是3’5’方向，DNA合成方向?yàn)?’－3’方向,切除修復(fù)在DNA聚合酶、連接酶等共同作用下，將DNA的損傷部位進(jìn)行切除、修補(bǔ)、連接，使損傷的DNA得以修復(fù)。切除修復(fù)是細(xì)胞修復(fù)損傷DNA的主要方式。,參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì),模板DNA原料NTPATP,UTP,GTP,CTP酶RNA聚合酶RNAPOLYMERASE其他蛋白質(zhì)因子,DNA分子上轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段，稱為結(jié)構(gòu)基因STRUCTURALGENE。轉(zhuǎn)錄的模板模板鏈DNA雙鏈中按堿基配對能指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄生成RNA的單股鏈；編碼鏈相對應(yīng)的另一條鏈。,不對稱轉(zhuǎn)錄ASYMMETRICTRANSCRIPTION,在DNA分子雙鏈上某一區(qū)段，一股鏈用作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄；模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一條單鏈上。,核心酶COREENZYME,全酶HOLOENZYME,原核RNA聚合酶,真核細(xì)胞的RNA聚合酶RNA聚合酶Ⅰ位于核仁中，轉(zhuǎn)錄出RRNARNA聚合酶Ⅱ位于核質(zhì)中，轉(zhuǎn)錄出HNRNA（MRNA的前體）RNA聚合酶Ⅲ位于核質(zhì)中，轉(zhuǎn)錄出TRNA和5SRRNA,真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后加工,MRNA（1）加帽（2）加尾（3）剪接（4）堿基修飾,從AUG開始，每三個核苷酸為一組編碼了一個氨基酸，稱為三聯(lián)體密碼CODON。成熟的MRNA由氨基酸編碼區(qū)和非編碼區(qū)構(gòu)成。5?末端的帽子CAP結(jié)構(gòu)和3?末端的多聚A尾POLYATAIL結(jié)構(gòu)。,,成熟的真核生物MRNA,蛋白質(zhì)的生物合成，即翻譯，就是將核酸中由4種核苷酸序列編碼的遺傳信息，通過遺傳密碼破譯的方式解讀為蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中20種氨基酸的排列順序。,20種氨基酸AA作為原料酶及眾多蛋白因子，如IF、EIFATP、GTP、無機(jī)離子,參與蛋白質(zhì)生物合成的物質(zhì)包括,三種RNAMRNA（MESSENGERRNA,信使RNA）RRNA（RIBOSOMALRNA,核蛋白體RNA）TRNA（TRANSFERRNA,轉(zhuǎn)移RNA）,TRNA與氨基酸的活化,反密碼環(huán),氨基酸臂,,,氨基酰TRNA合成酶,氨基酸的活化,IF3,IF1,IF2,,GTP,核蛋白體大亞基結(jié)合，起始復(fù)合物形成,,,,,目錄,酶的概念,目前將生物催化劑分為兩類酶、核酶（脫氧核酶）,酶是一類由活細(xì)胞產(chǎn)生的，對其特異底物具有高效催化作用的蛋白質(zhì)。,一、酶的分子組成,金屬輔助因子的作用,①維持酶分子構(gòu)象，甚至參與活性中心的形成；②作為連接酶與底物的橋梁，便于酶對底物起作用；③在酶分子中通過本身的氧化還原而傳遞電子；④中和陰離子，降低反應(yīng)中的靜電斥力，影響酶的活性中心。,小分子有機(jī)化合物的作用主要有維生素及其衍生物在反應(yīng)中起運(yùn)載體的作用，傳遞電子、質(zhì)子或其它基團(tuán)。,酶促反應(yīng)具有極高的效率酶促反應(yīng)具有高度的特異性酶促反應(yīng)的可調(diào)節(jié)性酶的高度不穩(wěn)定性,酶的催化特點(diǎn),酶的活性中心,或稱活性部位ACTIVESITE，指必需基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上彼此靠近，組成具有特定空間結(jié)構(gòu)的區(qū)域，能與底物特異結(jié)合并將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。,必需基團(tuán)ESSENTIALGROUP酶分子中氨基酸殘基側(cè)鏈的化學(xué)基團(tuán)中，一些與酶活性密切相關(guān)的化學(xué)基團(tuán)。,結(jié)合基團(tuán),催化基團(tuán),,酶促反應(yīng)動力學(xué)概念研究各種因素對酶促反應(yīng)速度的影響，并加以定量的闡述。影響因素包括有酶濃度、底物濃度、PH、溫度、抑制劑、激活劑等。,,※研究一種因素的影響時，其余各因素均恒定。,,※底物濃度對催化速率的影響1913年MICHAELIS和MENTEN提出反應(yīng)速度與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式，即米－曼氏方程式，簡稱米氏方程式MICHAELISEQUATION。,,,,S底物濃度V不同S時的反應(yīng)速度VMAX最大反應(yīng)速度MAXIMUMVELOCITYＫM米氏常數(shù)MICHAELISCONSTANT,KM與VMAX的意義,KM值①KM等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度。②意義AKM是酶的特征性常數(shù)之一；BKM可近似表示酶對底物的親和力；C同一酶對于不同底物有不同的KM值。,當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度，,,反應(yīng)速度不再增加，達(dá)最大速度。,,,,,目錄,VMAX定義VM是酶完全被底物飽和時的反應(yīng)速度，與酶濃度成正比。,雙重影響溫度升高，酶促反應(yīng)速度升高；由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度升高，可引起酶的變性，從而反應(yīng)速度降低。,三、溫度對反應(yīng)速度的影響,最適溫度OPTIMUMTEMPERATURE酶促反應(yīng)速度最快時的環(huán)境溫度。,四、PH對反應(yīng)速度的影響,最適PHOPTIMUMPH酶催化活性最大時的環(huán)境PH。,五、抑制劑對反應(yīng)速度的影響,酶的抑制劑INHIBITOR凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)稱為酶的抑制劑。,,,,區(qū)別于酶的變性,,抑制劑對酶有一定選擇性引起變性的因素對酶沒有選擇性,抑制作用的類型,不可逆性抑制酶與抑制劑共價結(jié)合,可逆性抑制酶與抑制劑非共價結(jié)合,競爭性抑制與底物競爭活性中心非競爭性抑制不與底物競爭活性中心反競爭性抑制,酶活性的調(diào)節(jié),,（一）酶原與酶原的激活,酶原ZYMOGEN有些酶在細(xì)胞內(nèi)合成或初分泌時只是酶的無活性前體，必須在一定條件下，這些酶的前體水解一個或幾個特定的肽鍵致使構(gòu)象發(fā)生改變，表現(xiàn)出酶的活性，這種無活性的前體稱為酶原,,,,,,酶原的激活,酶原向酶的轉(zhuǎn)化過程稱為酶的激活，其本質(zhì)是酶活性中心的形成與暴露的過程伴有酶蛋白一級結(jié)構(gòu)的改變,生理意義,消化系統(tǒng)中幾種蛋白酶以酶原的形式分泌出來，不僅避免了細(xì)胞的自身消化，而且保證酶在其特定的部位與環(huán)境發(fā)揮其催化作用。血液中的凝血因子在血液循環(huán)中以酶原的形式存在，能防止血液在血管內(nèi)凝固。還可視為酶的儲存形式,（二）別構(gòu)調(diào)節(jié),某些酶除了結(jié)合底物的部位（活性中心）以外，還有一個或幾個部位，當(dāng)專一的代謝物分子可逆結(jié)合到這些部位時，可引起酶的構(gòu)象發(fā)生變化，酶的活性中心也隨之變化，這種調(diào)節(jié)稱為酶的變構(gòu)調(diào)節(jié),（三）酶的共價修飾調(diào)節(jié),共價修飾COVALENTMODIFICATION在其他酶的催化作用下，某些酶蛋白肽鏈上的一些基團(tuán)可與某種化學(xué)基團(tuán)發(fā)生可逆的共價結(jié)合，從而改變酶的活性，此過程稱為共價修飾。,常見類型磷酸化與脫磷酸化（最常見）乙?；兔撘阴；谆兔摷谆佘栈兔撓佘栈璖H與－S－S互變,（四）同工酶,定義同工酶ISOENZYME是指催化相同的化學(xué)反應(yīng)，而酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)乃至免疫學(xué)性質(zhì)不同的一組酶。,糖代謝,糖代謝的概況,葡萄糖,丙酮酸,H2O及CO2,乳酸,乳酸、氨基酸、甘油,糖原,核糖NADPHH,淀粉,一、糖酵解的反應(yīng)過程,第一階段,第二階段,糖酵解GLYCOLYSIS的定義,糖酵解分為兩個階段,糖酵解的反應(yīng)部位胞漿,在缺氧情況下，葡萄糖生成乳酸LACTATE的過程稱之為糖酵解。,由葡萄糖分解成丙酮酸PYRUVATE，稱之為糖酵解途徑GLYCOLYTICPATHWAY。,由丙酮酸轉(zhuǎn)變成乳酸。,糖酵解的代謝途徑,E2,E1,E3,三、糖酵解的生理意義,1是機(jī)體在缺氧情況下獲取能量的有效方式。,2是某些細(xì)胞在氧供應(yīng)正常情況下的重要供能途徑。,②代謝活躍的細(xì)胞，如白細(xì)胞、骨髓細(xì)胞,①無線粒體的細(xì)胞，如紅細(xì)胞,在機(jī)體氧供充足時，葡萄糖徹底氧化成H2O和CO2，并釋放出能量的過程。是機(jī)體主要供能方式。,部位胞液及線粒體,糖的有氧氧化概念,一、有氧氧化的反應(yīng)過程,第一階段酵解途徑,第二階段丙酮酸的氧化脫羧,第三階段三羧酸循環(huán),G（GN）,第四階段氧化磷酸化,丙酮酸,乙酰COA,,,,,,,H2O,O,,ATP,ADP,TAC循環(huán),胞液,線粒體,（一）丙酮酸的氧化脫羧,丙酮酸進(jìn)入線粒體，氧化脫羧為乙酰COAACETYLCOA。,總反應(yīng)式,三羧酸循環(huán)TRICARBOXYLICACIDCYCLE,TAC也稱為檸檬酸循環(huán)，這是因?yàn)檠h(huán)反應(yīng)中的第一個中間產(chǎn)物是一個含三個羧基的檸檬酸。由于KREBS正式提出了三羧酸循環(huán)的學(xué)說，故此循環(huán)又稱為KREBS循環(huán)，它由一連串反應(yīng)組成。,所有的反應(yīng)均在線粒體中進(jìn)行。,（二）三羧酸循環(huán),概述,反應(yīng)部位,,,,,,,,,NADHH,NAD,,NAD,NADHH,GTP,GDPPI,FAD,,FADH2,NADHH,NAD,,⑧,①,②,③,④,⑤,⑥,⑦,②,,,,,,,,,,,①檸檬酸合酶,②順烏頭酸梅,③異檸檬酸脫氫酶,④Α酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體,⑤琥珀酰COA合成酶,⑥琥珀酸脫氫酶,⑦延胡索酸酶,⑧蘋果酸脫氫酶,,,,,目錄,1關(guān)于TCA的特征記憶,１、唯一一次底物水平磷酸化（產(chǎn)生１ATP）２、兩次連續(xù)脫羧反應(yīng)，生成２ＣＯ２３、三個限速酶４、四次脫氫產(chǎn)生11個ATP結(jié)論每個乙酰COA經(jīng)過一次TCA共生成12個ATP,2三羧酸循環(huán)的生理意義,是三大營養(yǎng)物質(zhì)氧化分解的共同途徑；是三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝聯(lián)系的樞紐；為其它物質(zhì)代謝提供小分子前體；為呼吸鏈提供HE。,葡萄糖有氧氧化生成的ATP,此表按傳統(tǒng)方式計(jì)算ATP。目前有新的理論，在此不作詳述,1葡萄糖磷酸化生成6磷酸葡萄糖,葡萄糖,6磷酸葡萄糖,糖原合成途徑,26磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)變成1磷酸葡萄糖,UDPG可看作“活性葡萄糖”，在體內(nèi)充作葡萄糖供體。,,31磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)變成尿苷二磷酸葡萄糖,1磷酸葡萄糖,尿苷二磷酸葡萄糖URIDINEDIPHOSPHATEGLUCOSE,UDPG,4Α1,4糖苷鍵式結(jié)合,此步的糖原合酶是限速酶,二、糖原的分解代謝,定義,亞細(xì)胞定位胞漿,肝糖元的分解,1糖原的磷酸解（限速）,糖原分解GLYCOGENOLYSIS習(xí)慣上指肝糖原分解成為葡萄糖的過程。,２1磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)變成6磷酸葡萄糖,３6磷酸葡萄糖水解生成葡萄糖,糖異生GLUCONEOGENESIS是指從非糖化合物轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟腔蛱窃倪^程。,部位,原料,糖異生概念,主要在肝、腎細(xì)胞的胞漿及線粒體,主要有乳酸、甘油、生糖氨基酸,1丙酮酸轉(zhuǎn)變成磷酸烯醇式丙酮酸PEP,丙酮酸,草酰乙酸,PEP,①丙酮酸羧化酶PYRUVATECARBOXYLASE，輔酶為生物素（反應(yīng)在線粒體）,②磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（反應(yīng)在線粒體、胞液）,21,6雙磷酸果糖轉(zhuǎn)變?yōu)?磷酸果糖,36磷酸葡萄糖水解為葡萄糖,糖異生的生理意義,（一）維持血糖濃度恒定,（二）補(bǔ)充肝糖原,三碳途徑指進(jìn)食后，大部分葡萄糖先在肝外細(xì)胞中分解為乳酸或丙酮酸等三碳化合物，再進(jìn)入肝細(xì)胞異生為糖原的過程。,（三）調(diào)節(jié)酸堿平衡（乳酸異生為糖）,乳酸循環(huán)LACTOSECYCLE（CORI循環(huán)）,⑴循環(huán)過程,葡萄糖,,葡萄糖,,葡萄糖,丙酮酸,乳酸,,乳酸,,乳酸,丙酮酸,血液,磷酸戊糖途徑概念,磷酸戊糖途徑是指由葡萄糖生成磷酸戊糖及NADPHH，前者再進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成3磷酸甘油醛和6磷酸果糖的反應(yīng)過程。,磷酸戊糖途徑的生理意義,（一）為核苷酸的生成提供核糖,（二）提供NADPH作為供氫體參與多種代謝反應(yīng),血糖，指血液中的葡萄糖。,血糖水平，即血糖濃度。正常血糖濃度389611MMOL/L,血糖及血糖水平的概念,,血糖,一、血糖來源和去路,二、血糖水平的調(diào)節(jié),主要依靠激素的調(diào)節(jié),舉例胰島素,①促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入肝外細(xì)胞；,②加速糖原合成，抑制糖原分解；,③加快糖的有氧氧化；,④抑制肝內(nèi)糖異生；,⑤減少脂肪動員。,體內(nèi)唯一降

簡介：MOLECULARBIOLOGY,主講人徐婧舒廣文,朱玉賢現(xiàn)代分子生物學(xué)，高等教育出版社閻隆飛分子生物學(xué)，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，李振剛分子遺傳學(xué)，科學(xué)出版社PC特納等分子生物學(xué)精要速覽科學(xué)出版社沈羽非真核基因表達(dá)調(diào)控，北京高等教育出版社LEWIN,B,GENESVII,OXFORDUNIVERSITYPRESSTURNERPCETALMOLECULARBIOLOGY科學(xué)出版社WEAVERRMOLECULARBIOLOGY科學(xué)出版社,,參考書目,,2005年2月出版,2004年2月出版,講授的內(nèi)容介紹,1、緒論2、染色體與DNA3、生物信息的傳遞（上）從DNA到RNA4、生物信息的傳遞（下）從MRNA到蛋白質(zhì)5、分子生物學(xué)研究方法6、基因的表達(dá)與調(diào)控（上）原核7、基因的表達(dá)與調(diào)控（下）真核8、疾病與人類健康（癌癥、病毒和基因治療）9、基因與發(fā)育10、基因組與比較基因組學(xué),1、熟知核酸的基本生物化學(xué)特性；2、熟知生物信息的儲存與表達(dá)過程；3、掌握DNA、RNA和蛋白質(zhì)的基本代謝過程，特別是基因的一般結(jié)構(gòu)與生物功能，基因活性的修飾與調(diào)節(jié)；4、掌握分子克隆與DNA重組的基本技術(shù)與原理，了解現(xiàn)代分子生物學(xué)基本研究方法，了解基因治療與基因組學(xué)的新成果，新進(jìn)展。,分子生物學(xué)的基本要求,第一章緒論,回顧所學(xué)知識點(diǎn)分子生物學(xué)定義分子生物學(xué)發(fā)展簡史分子生物學(xué)研究內(nèi)容分子生物學(xué)展望,一、回顧所學(xué)知識點(diǎn),1、創(chuàng)世說與進(jìn)化論,,達(dá)爾文、1859年物種起源，確立了進(jìn)化論的概念,,2、細(xì)胞學(xué)說（1847）,,德國SCHLEIDEN,德國SCHWANN,,細(xì)胞學(xué)說的主要內(nèi)容有①細(xì)胞是有機(jī)體，一切動植物都是由單細(xì)胞發(fā)育而來，即生物是由細(xì)胞和細(xì)胞的產(chǎn)物所組成；②所有細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和組成上基本相似；③新細(xì)胞是由已存在的細(xì)胞分裂而來；④生物的疾病是因?yàn)槠浼?xì)胞機(jī)能失常。,3、經(jīng)典的生物化學(xué)和遺傳學(xué),●19世紀(jì)中葉，蛋白質(zhì)●19世紀(jì)中葉到20世紀(jì)初，組成蛋白質(zhì)的20種基本氨基酸被相繼發(fā)現(xiàn)（1935年，蘇氨酸）●著名生物化學(xué)家FISHER還論證了連接相鄰氨基酸的“肽鍵”的形成。,,孟德爾GREGORMENDEL18221884,奧地利科學(xué)家，經(jīng)典遺傳學(xué)的奠基人,,18571864的7年中，進(jìn)行了豌豆的雜交研究，1865年發(fā)表了他的劃時代的論文植物雜交試驗(yàn)在論文中提出了“遺傳因子”的概念，并得出了三條規(guī)律,顯性規(guī)律THELAWOFDOMINANCE分離規(guī)律（THELAWOFSEGREGATION）自由組合規(guī)律（THELAWOFINDEPENDENTASSORTMENT）,在孟德爾遺傳學(xué)的基礎(chǔ)上，美國著名的遺傳學(xué)家MORGAN又提出了基因?qū)W說。連鎖遺傳規(guī)律,第一章緒論,回顧所學(xué)知識點(diǎn)分子生物學(xué)定義分子生物學(xué)發(fā)展簡史分子生物學(xué)研究內(nèi)容分子生物學(xué)展望,二、分子生物學(xué)定義,,從分子水平研究生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能從而闡明生命現(xiàn)象本質(zhì)的科學(xué)，主要指遺傳信息的傳遞（復(fù)制）、保持（損傷和修復(fù)）、基因的表達(dá)（轉(zhuǎn)錄和翻譯）與調(diào)控。,第一章緒論,回顧所學(xué)知識點(diǎn)分子生物學(xué)定義分子生物學(xué)發(fā)展簡史分子生物學(xué)研究內(nèi)容分子生物學(xué)展望,三、分子生物學(xué)發(fā)展簡史,1、孕育階段（18201950年代）●1865年，孟德爾發(fā)表了他的植物雜交實(shí)驗(yàn)一文，首次闡述了生物界有規(guī)律的遺傳現(xiàn)象?！斑z傳因子”●1900年，孟德爾遺傳規(guī)律被證實(shí)，成為近代遺傳學(xué)基礎(chǔ)?！?910年，MORGAN的染色體基因遺傳理論，GENE存在于染色體上。進(jìn)一步將“性狀”與“基因”相耦聯(lián)，成為現(xiàn)代遺傳學(xué)的奠基石。,●1944年，美國微生物學(xué)家AVERY證明基因就是DNA分子，提出DNA是遺傳信息的載體。,,1957年，HEINZFRAENKELCONRAT和BSINGRE的雜合病毒實(shí)驗(yàn),煙草花葉病毒的感染和繁殖過程－證實(shí)RNA也是重要的遺傳物質(zhì),2、創(chuàng)立階段（19501970年代）,●1953年，美國科學(xué)家WATSON和英國科學(xué)家CRICK提出DNADOUBLEHELIXMODEL,,1962年WATSON、CRICK與WILKINS共享諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎,通過對DNA分子的X射線衍射研究證實(shí)了前兩者提出的DNA的模型,●1958年CRICK提出中心法則。,中國科學(xué)院2001年碩士入學(xué)考試分子遺傳學(xué)試題何謂中心法則如何基于該法則來解釋生物形狀的遺傳和變異（10分）,,,●1958年，MESELSON和STAHL證明DNA半保留復(fù)制。半保留復(fù)制是遺傳消息能準(zhǔn)確傳代的保證。是物質(zhì)穩(wěn)性的分子基礎(chǔ)。,STAHL,MESELSON,,,●1959年，美籍西班牙裔科學(xué)家OCHOA發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的多核苷酸磷酸化酶，合成了核糖核酸；美國KORNBERG實(shí)現(xiàn)了DNA分子在細(xì)菌細(xì)胞和試管內(nèi)的復(fù)制，而分享了諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。,,●1961年，法國科學(xué)家JACOB（雅各布）和MONOD（莫諾）提出操縱子學(xué)說（第六章）,,●1968年，NIRENBERG、HOLLEY和KHORANA解讀了遺傳密碼及其在蛋白質(zhì)合成方面的技能而分享諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。,,3、發(fā)展階段（1970年代以后）●1970年，TEMIN和BALTIMORE在RNA腫瘤病毒中發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶。,,,1980年，與GILBERT和BERG共享諾貝爾化學(xué)獎,SANGER還由于測定了牛胰島素的一級結(jié)構(gòu)而獲得1958年諾貝爾化學(xué)獎。,1983BARBARAMCCLINTOCK86Y,DNATRANSPOSABLEELEMEMT,●1983年，美國遺傳學(xué)家MCCLINTOCK因發(fā)現(xiàn)可移動的遺傳因子而獲得諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。,1989年ALTMAN、CECH發(fā)現(xiàn)核酶,1997年，普魯西納朊病毒PRION,,什么是遺傳學(xué)中心法則為什么說阮病毒的發(fā)現(xiàn)是對此法則提出了挑戰(zhàn)5分北師大2000年碩士研究生生物化學(xué)試題,第一章緒論,回顧所學(xué)知識點(diǎn)分子生物學(xué)定義分子生物學(xué)發(fā)展簡史分子生物學(xué)研究內(nèi)容分子生物學(xué)展望,四、分子生物學(xué)研究內(nèi)容,,●DNA重組技術(shù)（基因工程）●基因的表達(dá)調(diào)控●生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能研究結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)）●基因組、功能基因組與生物信息學(xué)研究,●DNA重組技術(shù),是20世紀(jì)70年代初興起的技術(shù)科學(xué)，目的是將不同DNA片段按照人們的設(shè)計(jì)定向連接起來，在特定的受體細(xì)胞中與載體同時復(fù)制并得到表達(dá)，產(chǎn)生影響受體細(xì)胞的新的遺傳性狀。DNA重組技術(shù)是核酸化學(xué)、酶工程及遺傳學(xué)等長期深入研究的結(jié)晶，而限制性內(nèi)切酶DNA連接酶及其他工具酶的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用則是這一技術(shù)得以建立的關(guān)鍵。,,應(yīng)用1、可被用于大量生產(chǎn)某些在正常細(xì)胞代謝中產(chǎn)量很低的多肽2、可用于定向改造某些生物的基因組結(jié)構(gòu)3、可被用來進(jìn)行基礎(chǔ)研究,1972BERG,ECORIRECOGNITIONSITES,,,ΛPHAGEDNA,,ECORICUTSDNAINTOFRAGMENTS,,STICKYEND,SV40DNA,,,THETWOFRAGMENTSSTICKTOGETHERBYBASEPAIRING,,DNALIGASE,RECOMBINANTDNA,,,重組DNA操作過程示意圖,●基因的表達(dá)調(diào)控,基因的表達(dá)調(diào)控表現(xiàn)在三方面信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究轉(zhuǎn)錄因子研究RNA剪接,蛋白質(zhì)分子控制了細(xì)胞的一切代謝活動，而決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和合成時序的信息都由核酸（主要是脫氧核糖核酸）分子編碼，所以，基因表達(dá)實(shí)質(zhì)上就是遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。,結(jié)構(gòu)分子生物學(xué),研究三維結(jié)構(gòu)及其運(yùn)動規(guī)律，研究生物大分子特定的空間結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)的運(yùn)動變化與其生物學(xué)功能的關(guān)系。X射線衍射的晶體學(xué)（又稱蛋白質(zhì)晶體學(xué)）二維和多維核磁共振法液相結(jié)構(gòu)電鏡三維重組、電子衍射、中子衍射和各種頻譜學(xué)方法研究生物高分子的空間結(jié)構(gòu)。,第一章緒論,回顧所學(xué)知識點(diǎn)分子生物學(xué)定義分子生物學(xué)發(fā)展簡史分子生物學(xué)研究內(nèi)容分子生物學(xué)展望,五、分子生物學(xué)展望,21世紀(jì)是生命科學(xué)世紀(jì)，生物經(jīng)濟(jì)時代結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)、信號跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)成為新的熱門領(lǐng)域。,課后題,何謂中心法則如何基于該法則來解釋生物形狀的遺傳和變異為什么說阮病毒的發(fā)現(xiàn)是對此法則提出了挑戰(zhàn),

簡介：第四章基因突變的分子細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng),本章重點(diǎn)內(nèi)容,遺傳性酶病和分子病等基本概念基因突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能改變的機(jī)制基因突變引起性狀改變的分子機(jī)制,蛋白質(zhì)的合成與運(yùn)輸途徑,蛋白質(zhì)的合成與運(yùn)輸途徑,SRP,,第一節(jié)基因突變對蛋白質(zhì)產(chǎn)生的影響,影響蛋白質(zhì)的生物合成改變蛋白質(zhì)的功能效應(yīng)改變蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位,突變對蛋白質(zhì)合成的影響,影響MRNA和蛋白質(zhì)合成的突變影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的突變影響蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的突變影響蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)結(jié)合的突變影響輔基或輔助因子與蛋白質(zhì)結(jié)合、去除的突變影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,原發(fā)性損害繼發(fā)性損害,突變對蛋白質(zhì)合成的影響,影響MRNA和蛋白質(zhì)合成的突變原發(fā)性缺陷①Β地中海貧血↓②遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)癥↑繼發(fā)性缺陷急性間歇性卟啉癥（AIP）,突變對蛋白質(zhì)合成的影響,影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的突變原發(fā)性缺陷血紅蛋白疏水區(qū)被極性氨基酸取代留下間隙繼發(fā)性缺陷EHLERSDANLOS綜合征Ⅱ型（賴氨酸羥化酶缺陷）,突變對蛋白質(zhì)合成的影響,影響蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的突變原發(fā)性缺陷甲基丙二酸尿癥,甲基丙二酰輔A羧基變位酶與琥珀酰COA的合成,影響蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的突變,繼發(fā)性缺陷包涵體細(xì)胞病Α甘露糖酶缺乏溶酶體中的水解分子帶有獨(dú)特的標(biāo)記甘露糖6磷酸M6P，它是溶酶體水解酶分選的重要識別信號,,突變對蛋白質(zhì)合成的影響,影響蛋白質(zhì)與其它多肽鏈結(jié)合的突變原發(fā)性缺陷親和力PROΑ1Ⅰ和PROΑ2Ⅰ基因突變→形成Ⅰ型膠原困難→骨發(fā)育不良。繼發(fā)性缺陷ZELLWEGER綜合征胎盤鐵轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙過氧化物酶體,突變對蛋白質(zhì)合成的影響,影響輔基或輔助因子與蛋白質(zhì)結(jié)合、去除的突變原發(fā)性缺陷同型胱氨酸尿癥胱硫醚合成酶輔助因子磷酸吡哆醛繼發(fā)性缺陷有關(guān)的酶發(fā)生缺陷,突變對蛋白質(zhì)功能的改變,功能丟失的突變功能加強(qiáng)的突變新特性的突變,突變對蛋白質(zhì)功能的效應(yīng),突變蛋白的細(xì)胞定位與病理生理發(fā)生部位,組織特異性蛋白突變苯丙酮尿癥肝腎苯丙氨酸羥化酶缺陷持家蛋白的突變尿素循環(huán)代謝障礙精氨酸琥珀酸合成酶和精氨酸琥珀酸裂解酶（肝）,第二節(jié)基因突變引起性狀改變的機(jī)制,酶蛋白分子基因突變→酶缺陷→代謝缺陷非酶蛋白分子,基因突變引起酶缺陷,結(jié)構(gòu)基因突變引起的酶結(jié)構(gòu)改變酶完全失去活性酶具一定的活性，但穩(wěn)定性降低酶與底物的親和力降低復(fù)合酶的酶蛋白分子與輔助因子的親和力下降調(diào)節(jié)基因突變引起酶合成速度下降不能合成MRNA降低MRNA的合成量,酶缺陷引起代謝缺陷,酶與代謝反應(yīng)的關(guān)系,酶的生成和體內(nèi)酶促反應(yīng),酶缺陷引起代謝缺陷,酶缺陷對代謝反應(yīng)的影響膜轉(zhuǎn)運(yùn)酶的缺陷,色氨酸代謝示意圖,酶缺陷引起代謝缺陷,酶缺陷對代謝反應(yīng)的影響酶缺陷導(dǎo)致中間產(chǎn)物或底物的堆積底物的堆積本身對機(jī)體有害半乳糖血癥,酶缺陷引起代謝缺陷,酶缺陷導(dǎo)致中間產(chǎn)物或底物的堆積底物的堆積本身對機(jī)體有害底物的堆積本身無害，但激發(fā)次要代謝途徑的開放,1苯丙酮尿癥；2尿黑酸尿癥；3白化病,酶缺陷引起代謝缺陷,酶缺陷導(dǎo)致代謝終產(chǎn)物減少或缺乏,1苯丙酮尿癥；2尿黑酸尿癥；3白化病,酶缺陷引起代謝缺陷,酶缺陷導(dǎo)致反饋調(diào)節(jié)機(jī)制紊亂先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥21羥化酶,腎上腺皮質(zhì)激素的合成,直接引起疾病底物堆積次要途徑開放產(chǎn)生有毒物質(zhì)→間接致病,產(chǎn)物不足反饋調(diào)節(jié)機(jī)制紊亂→間接致病代謝受阻,酶缺陷引起代謝缺陷,,,直接引起疾病,酶缺陷↓,,