支架蛋白RACK1及其突變體與氯離子通道蛋1(CLIC1)相互作用的研究.pdf

1、目的：為了研究RACK1及其突變體與氯離子通道蛋白CLIC1的相互作用，運(yùn)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建帶FLAG標(biāo)簽的RACK1突變體的真核表達(dá)質(zhì)粒，原核表達(dá)質(zhì)粒和CLIC1的原核表達(dá)質(zhì)粒，通過酵母雙雜交，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，免疫熒光，免疫共沉淀和GST-pulldown等實(shí)驗(yàn)研究在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)的共定位及相互作用。
　　方法：以pcDNA3.1-RACK1重組質(zhì)粒為模板，運(yùn)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建重組酵母質(zhì)粒pGBKT7/pGADT7-RACK1，p

2、GBKT7/pGADT7-RACK1-N(1-138)，pGBKT7/pGADT7-RACK1-C(130-317)，分別與實(shí)驗(yàn)室保存的CLIC1的酵母表達(dá)質(zhì)粒，共同轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞（ΑH109）中，并在SD3-(-Leu/-His/-Trp)培養(yǎng)基上進(jìn)行營養(yǎng)篩選，對長出的克隆進(jìn)行半乳糖苷酶（X-α-gαl）活性測定，通過觀察克隆變藍(lán)情況來驗(yàn)證RACK1及其突變體是否與CLIC1存在相互作用；構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-RACK1-

3、N(1-138)-FLAG、pcDNA3.1-RACK1-C(130-317)-FLAG及原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-5X-3-RACK1-N(1-138)、pGEX-5X-3-RACK1-C(130-317)、pGEX-5X-3-CLIC1；用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察蛋白在 COS7細(xì)胞內(nèi)的定位情況；將RACK1全長及其缺失突變體轉(zhuǎn)染入HEK293T或COS7細(xì)胞中，分別提取胞質(zhì)蛋白與核蛋白，利用Western blot法檢測蛋白在胞質(zhì)與胞

4、核中表達(dá)情況，進(jìn)一步說明蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位情況；并與pCDGFP-CLIC1共轉(zhuǎn)染到HEK293T或COS7細(xì)胞中，通過免疫共沉淀技術(shù)檢測RACK1及其突變體蛋白與CLIC1蛋白在體內(nèi)是否相互作用；從轉(zhuǎn)染了相關(guān)質(zhì)粒的BL21感受態(tài)細(xì)胞中純化GST-CLIC1，GST-RACK1，GST-RACK1-N和GST-RACK1-C融合蛋白，然后進(jìn)行GST-pulldown實(shí)驗(yàn)，檢測蛋白在體外相互作用情況。
　　結(jié)果：酶切鑒定和測序結(jié)果

5、表明成功構(gòu)建了實(shí)驗(yàn)相關(guān)的重組質(zhì)粒。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)顯示，共同表達(dá)了CLIC1和RACK1或突變體(RACK1-N)這兩種蛋白的酵母細(xì)胞在SD3-培養(yǎng)基中能夠正常生長，且克隆在進(jìn)行α-半乳糖苷酶活性測定后大多數(shù)顏色變藍(lán)，即證明二者可能存在相互作用。分離胞質(zhì)蛋白與核蛋白，Western blot結(jié)果表明在胞質(zhì)與胞核中均有表達(dá)，以細(xì)胞質(zhì)為主，共聚焦熒光顯微鏡觀察到野生型RACK1蛋白和突變體蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)與核膜處，細(xì)胞核中也有一定量的分布

6、，與在細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核均有分布的CLIC1蛋白有共定位現(xiàn)象存在。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明野生型RACK1蛋白及突變體蛋白都和CLIC1蛋白存在相互作用。在最佳條件下成功誘導(dǎo)表達(dá)GST-CLIC1蛋白、GST-RACK1蛋白、GST-RACK1-N蛋白、GST-RACK1-C蛋白，GST-pulldown實(shí)驗(yàn)表明野生型RACK1蛋白及突變體蛋白都可以和CLIC1蛋白相互作用。
　　結(jié)論：酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)表明野生型RACK1及其突變體蛋白與CLI