miRNA-30c靶向抑制cxcr4a和調(diào)控胚胎中內(nèi)胚層器官形成.pdf

1、目的:
　　探討miR-30c在調(diào)控細(xì)胞分化中的作用及對(duì)脊椎動(dòng)物早期胚胎發(fā)育的影響。
　　方法:
　　1、生物信息學(xué)分析:1）從miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mirbase.org/)中獲取各物種miR-30家族成員的核苷酸序列，并用軟件Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì)。2）以miR-30家族成員各自原始轉(zhuǎn)錄本(pri-miR-30)核苷酸序列為基礎(chǔ)的種系樹(shù)由軟件MEGA5中鄰接法(neighbor-jo

2、iningmethod)計(jì)算建立。
　　2、TaqMan PCR技術(shù)和胚胎整體原位雜交技術(shù):斑馬魚(yú)基因組DNA抽提，PCR和探針質(zhì)粒構(gòu)建，地高辛標(biāo)記反義RNA探針準(zhǔn)備，胚胎整體原位雜交，基于TaqMan PCR技術(shù)的miRNA表達(dá)分析。
　　3、顯微注射miR-30c-duplex、顯微注射嗎啡啉（morpholino）環(huán)標(biāo)記的反義寡核苷酸:分別將morpholino（嗎啡啉修飾反義寡核苷酸鏈morpholino,dre-m

3、iR-30c-MO）、duplex(miR-30c-duplex)和mRNA(體外轉(zhuǎn)錄合成的egfp-cxcr4a-3'UTR mRNA、egfp-cxcr4a-3'UTR(miR-30cmut)mRNA)經(jīng)顯微注射進(jìn)入胚胎細(xì)胞并設(shè)對(duì)照組。
　　4、進(jìn)行miRNA靶基因預(yù)測(cè)分析并和全胚胎miRNA靶基因報(bào)道系統(tǒng)比對(duì)。
　　結(jié)果:
　　1、miR-30c母源性低表達(dá)，原腸后期至體節(jié)中期呈廣泛表達(dá)且中內(nèi)胚層表達(dá)豐富，受精后

4、24小時(shí)特異性表達(dá)于胚胎原腎管。
　　2、過(guò)表達(dá)miR-30c斑馬魚(yú)胚胎表現(xiàn)為中內(nèi)胚層細(xì)胞向胚胎中線(xiàn)遷移能力下降，最終呈現(xiàn)雙心畸形和內(nèi)臟畸形。
　　3、特異性抑制miR-30c的成熟，可增強(qiáng)斑馬魚(yú)胚胎中內(nèi)胚層細(xì)胞向中線(xiàn)遷移的能力。
　　4、細(xì)胞遷移相關(guān)因子cxcr4a是miR-30c的潛在靶基因之一。
　　結(jié)論:
　　1、初步探討miR-30c在胚胎發(fā)生早期的時(shí)空表達(dá)模式。
　　2、miR-30c是中