miRNA-30c在胃癌中的作用機(jī)制及臨床應(yīng)用價(jià)值.pdf

1、目的：
　　檢測(cè)miR-30c在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，進(jìn)行體外功能試驗(yàn)，確定下游靶標(biāo)，探討miR-30c異常表達(dá)與胃癌發(fā)生的相關(guān)性并揭示相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法：
　?。?）閱讀文獻(xiàn)結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)室獲得的miRNA芯片表達(dá)數(shù)據(jù)，預(yù)測(cè)miR-30c調(diào)節(jié)的靶基因。
　?。?）采用Real-time PCR技術(shù)驗(yàn)證82對(duì)胃癌組織與癌旁遠(yuǎn)端組織樣本中miR-30c、myc和PPARδ表達(dá)差異。
　?。?）體

2、外培養(yǎng)分化不同的2株胃癌細(xì)胞，以獲得永生化而無致癌性的人胃黏膜上皮細(xì)胞為對(duì)照。對(duì)體外培養(yǎng)的生長(zhǎng)增殖期細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，采用miR-30c-mimic、miR-30c-inhibitor和Negtive Control（NC）調(diào)控胃癌細(xì)胞中miR-30c的表達(dá)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后進(jìn)行MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡情況，qRT-PCR、WesternBlot檢測(cè)miR-30c靶蛋白BCL-9及下游基因Myc和PPARδ的表達(dá)

3、情況。
　　（4）常規(guī)進(jìn)行組織標(biāo)本包埋、切片、系列脫蠟后采用免疫組化技術(shù)研究胃癌組織中BCL-9和GJA1的表達(dá)情況，并分析預(yù)測(cè)靶基因BCL-9和GJA1的差異表達(dá)與患者臨床資料的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　?。?）從前期胃癌miRNAs表達(dá)譜微陣列芯片篩選出一系列表達(dá)升高或降低的miRNAs，其中下調(diào)最顯著為miR-30c，下調(diào)8.36倍（P<0.05）。采用Real-time PCR技術(shù)擴(kuò)大樣本進(jìn)行驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)在82

4、對(duì)胃癌組織與癌旁遠(yuǎn)端組織配對(duì)樣本中，miR-30c在胃癌組織中呈低表達(dá)（P<0.05）,其表達(dá)趨勢(shì)與芯片結(jié)果一致。且miR-30c表達(dá)下調(diào)水平與患者年齡相關(guān)（P<0.05）。
　?。?）轉(zhuǎn)染miR-30c-mimic后細(xì)胞的增殖能力顯著降低，MKN-45在轉(zhuǎn)染后72h抑制率最高為18％，但與NC組比較在24h、48h、72h組間沒有差異（P>0.05）。MKN-74轉(zhuǎn)染后72h抑制率最高為17%，且較NC組24h與48和72小時(shí)有

5、差異（P<0.05）。GES-1則在轉(zhuǎn)染后48h達(dá)到最高抑制率26%，在48h與24和72小時(shí)與NC組相比較抑制率存在差異（P<0.05）。但是,轉(zhuǎn)染miR-30c-inhibitor后，細(xì)胞的增殖能力則增強(qiáng)，MKN-45在轉(zhuǎn)染24h后細(xì)胞增殖提高18%，與NC組比較24h與48和72小時(shí)組間比較存在差異（P<0.05）。MKN-74在轉(zhuǎn)染后48h達(dá)到30%，在24h、48h、72h時(shí)與NC組比較組間存在差異（P<0.05）。GES-1

6、則在轉(zhuǎn)染后72h時(shí)細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)12%，且24h、48h、72h時(shí)與NC組比較組間存在差異（P<0.05）。
　?。?）miRNA-30c-mimic轉(zhuǎn)染三株細(xì)胞48h后，MKN-74細(xì)胞凋亡率則較NC組降低（P<0.05），而在GES-1細(xì)胞系中miRNA-30c-mimic組較NC組凋亡率升高（P<0.05）。轉(zhuǎn)染miRNA-30c-inhibitor48h后，MKN-45凋亡比率較NC組升高（P<0.05），MKN-74細(xì)

7、胞凋亡率則較NC組降低（P<0.05），進(jìn)一步比較可以發(fā)現(xiàn)，在MKN74和GES-1細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染miRNA-30c-mimic較miRNA-30c-inhibitor組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P<0.05），即miRNA-30c-mimic促進(jìn)凋亡，miRNA-30c-inhibitor則可以抑制凋亡，而在MKN45中則反之，
　?。?）在MKN45細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染miR-30c-mimic后較NC組G0/G1期細(xì)胞數(shù)量增加（ P<0.

8、05），而在MKN74和GES1細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染miR-30c-inhibitor后較NC組G0/G1期細(xì)胞數(shù)量增加（P<0.05）。
　?。?）Real-time PCR檢測(cè)顯示胃癌及癌旁組織中PPARδ和Myc在癌組織中表達(dá)降低，但與癌旁組織比較差異無顯著性（P>0.05）。進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，我們發(fā)現(xiàn)，除GES-1細(xì)胞外，myc基因和PPARδ基因的表達(dá)同之前胃癌組織與癌旁組織的表達(dá)一致，即miR-30c高表達(dá)則下游myc基因和P

9、PARδ基因也呈現(xiàn)高表達(dá)，反之則低表達(dá)。
　　（6）Western Blot檢測(cè)顯示，在MKN-74細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染miR-30c-mimic后較NC組（陰性對(duì)照組）BCL-9表達(dá)升高，轉(zhuǎn)染miRNA-30c-inhibitor后BCL9的表達(dá)較NC組降低；而在永生化的GES-1細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染miR-30c-mimic后，BCL-9表達(dá)較NC組均有所降低，但轉(zhuǎn)染miR-30c-inhibitor后，BCL-9表達(dá)增高較NC組明顯升高。

10、
　　（7）免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，胃癌組織中BCL-9、GJA1的表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、是否有淋巴轉(zhuǎn)移、是否有脈管侵犯等臨床資料無關(guān)（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　?。?）miR-30c在胃癌組織中呈低表達(dá)，并通過改變細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展。
　?。?）miR-30c表達(dá)下調(diào)水平與患者年齡相關(guān)。
　　(3)miR-30c對(duì)BCL9的調(diào)節(jié)關(guān)系在不同分化細(xì)胞系中影響不一，可能是多