DDR2的相互作用分子——Vimentin在RA滑膜MMPs過分泌及FLS細(xì)胞侵襲、遷移中的作用研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種以侵襲性、慢性、進(jìn)行性、致殘性關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的全身性自身免疫病[1]。若不及時(shí)治療，病情會(huì)迅速發(fā)展，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷加劇，最終造成關(guān)節(jié)畸形、功能喪失，具有極高的致殘率。因此，系統(tǒng)地闡明參與RA關(guān)節(jié)鄰近骨、軟骨損傷的相關(guān)信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)其中的關(guān)鍵分子及調(diào)控機(jī)制，既能為RA的發(fā)生、發(fā)展提出新的理論認(rèn)識(shí)，還能為RA的臨床治療提供潛在的藥物作用靶點(diǎn)。
　　現(xiàn)有的研究表

2、明：RA的基本病理特征是周身關(guān)節(jié)滑膜炎癥的累積以及血管翳形成。血管翳中的免疫病理成分可分為免疫和侵蝕兩部分[2]。其中侵蝕部分主要由鄰近骨、軟骨的破骨細(xì)胞（Osteoclast）和滑膜成纖維細(xì)胞（Synovial Fibroblast，SF）構(gòu)成，滑膜成纖維細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞（Fibroblast-LikeSynovialCells，F(xiàn)LS）。FLS過度分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metallopr

3、oteinase，MMPs）被認(rèn)為是RA骨、軟骨破壞的“罪魁禍?zhǔn)住?。RA組織中的MMPs直接參與了對(duì)關(guān)節(jié)骨、軟骨的降解，產(chǎn)生的Ⅱ型膠原（CollageⅡ）又能誘導(dǎo)FLS分泌MMPs，進(jìn)而形成惡性循環(huán)，加劇關(guān)節(jié)骨、軟骨的破壞。
　　我們前期發(fā)現(xiàn)：①盤狀結(jié)構(gòu)域受體2（DDR2）在RA患者滑膜組織及FLS細(xì)胞中高表達(dá)，并呈持續(xù)活化狀態(tài)[3,4]；②原代培養(yǎng)的RA患者FLS細(xì)胞能夠持續(xù)高水平分泌MMP1、MMP13等與RA關(guān)節(jié)鄰近骨、軟骨

4、病理?yè)p傷直接相關(guān)的MMPs分子[5]；③ DDR2可通過調(diào)節(jié)AP1、Runx2的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控MMP1、MMP13等MMPs分子的表達(dá)[5]；④通過對(duì)DDR2受體胞外區(qū)的研究，我們發(fā)現(xiàn)DDR2胞外區(qū)可以阻斷Ⅱ型膠原與DDR2的結(jié)合并可抑制RA滑膜細(xì)胞分泌MMP-1[6]；此外，我們還在針對(duì)（collagen-induced arthritis,CIA）大鼠關(guān)節(jié)炎模型的研究中發(fā)現(xiàn)，可溶性的DDR2可改善RA關(guān)節(jié)鄰近骨、軟骨的損傷[7]。

5、r>　　盡管前期我們以DDR2在RA發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中的功能研究為切入點(diǎn)，進(jìn)行了一些研究并取得了一些成果，但是仍有許多問題值得深入探討：1. DDR2是分布在FLS細(xì)胞膜表面的具有酪氨酸蛋白激酶活性的受體，Ⅱ型膠原使DDR2發(fā)生磷酸化激活之后，它會(huì)結(jié)合哪些分子？2.這些分子是磷酸化分子還是非磷酸化分子？3.它們的功能又是什么？能夠調(diào)控MMPs的表達(dá)嗎？
　　對(duì)于上述問題的回答有利于闡明DDR2介導(dǎo)RA FLS細(xì)胞MMPS過分泌的分子

6、機(jī)制，并系統(tǒng)揭示Ⅱ型膠原作用下的RA關(guān)節(jié)鄰近骨、軟骨損傷的機(jī)制。因此，我們?cè)谇捌诠ぷ鞯幕A(chǔ)之上，擬從以下三個(gè)方面展開研究：①利用DDR2過表達(dá)慢病毒上調(diào)FLS細(xì)胞中DDR2的表達(dá)水平，以DDR2的相互作用分子為突破口，利用免疫沉淀結(jié)合SDS-PAGE的方法獲得DDR2的相互作用分子，并利用多肽質(zhì)譜確定其身份。結(jié)合生物信息學(xué)分析和相關(guān)文獻(xiàn)的研究結(jié)果，我們以篩選得到的DDR2相互作用分子--波形蛋白（Vimentin）為研究對(duì)象，利用免疫共

7、沉淀確定DDR2與Vimentin的相互作用關(guān)系，利用激光共聚焦顯微鏡觀察Vimentin與DDR2在FLS細(xì)胞中的表達(dá)及分布情況。②利用RNAi、Real-time PCR、Western Blot等實(shí)驗(yàn)手段，考察DDR2活化后對(duì)Vimentin的表達(dá)及磷酸化狀態(tài)的影響。并以Vimentin的功能研究為切入點(diǎn)，考察Vimentin對(duì)MMPs及FLS細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響。③最后，我們以骨性關(guān)節(jié)炎（OA）患者的滑膜組織為陰性對(duì)照，擴(kuò)大

8、樣本數(shù)，系統(tǒng)考察Vimentin在RA患者滑膜組織中的表達(dá)、分布情況，進(jìn)一步評(píng)價(jià)其臨床意義。
　　通過上述實(shí)驗(yàn)的開展，我們得到以下結(jié)果：①通過免疫沉淀結(jié)合SDS-PAGE分離的方法，得到了8個(gè)DDR2相互作用蛋白，經(jīng)多肽質(zhì)譜和生物信息學(xué)分析，確定了8個(gè)蛋白的身份，我們選擇Vimentin作為下一步的研究對(duì)象；②在HEK293T細(xì)胞中，通過免疫共沉淀的手段，確認(rèn)了活化的DDR2與Vimentin的相互作用關(guān)系；③利用激光共聚焦顯微鏡

9、觀察發(fā)現(xiàn)DDR2與Vimentin在RA FLS細(xì)胞中存在共定位關(guān)系；④用Ⅱ型膠原活化RA FLS細(xì)胞膜上的DDR2后，Vimentin的表達(dá)水平變化不大，但Vimentin的磷酸化水平顯著升高；⑤ Vimentin的磷酸化激活可以促進(jìn)RA FLS中MMP13的表達(dá)；⑥ Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Vimentin的磷酸化激活能夠促進(jìn)RA FLS細(xì)胞的侵襲、遷移；⑦在擴(kuò)大樣本量后，以O(shè)A患者滑膜組織為對(duì)照，RA患者

10、滑膜組織中Vimentin的表達(dá)水平與磷酸化水平均高于OA滑膜組織。
　　通過本研究，我們首次證實(shí)了Vimentin與活性型DDR2的相互作用關(guān)系，并且作為DDR2的相互作用分子，Vimentin在介導(dǎo)RA FLS細(xì)胞MMPs過分泌及促進(jìn)RA FLS細(xì)胞侵襲、遷移和關(guān)節(jié)軟骨破壞過程中扮演了重要角色。上述研究結(jié)果補(bǔ)充和完善了我們課題組提出的Ⅱ型膠原-DDR2-MMPs通路在介導(dǎo) RA關(guān)節(jié)軟骨侵襲、破壞機(jī)制中的關(guān)鍵分子和重要環(huán)節(jié)，既為