傷寒沙門(mén)菌sufC基因及t4606基因的生物學(xué)功能分析.pdf

1、目的:
　　課題組前期研究發(fā)現(xiàn)傷寒沙門(mén)菌sufC及t4606基因的表達(dá)受兩個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子RpoE和RpoS的雙重調(diào)控，推測(cè)其可能在傷寒沙門(mén)菌致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。sufC在其他腸道致病菌中對(duì)鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)至關(guān)重要，參與細(xì)菌對(duì)抗宿主細(xì)胞的氧化應(yīng)激；傷寒沙門(mén)菌t4606基因編碼一未知功能的蛋白質(zhì)，對(duì)其基因序列分析發(fā)現(xiàn)具有Patatin-like phospholipase的功能基序，本研究旨在對(duì)sufC基因及t4606基因在傷寒沙門(mén)

2、菌中的功能進(jìn)行鑒定，揭示兩者在傷寒沙門(mén)菌致病過(guò)程中的作用。
　　方法:
　　一、傷寒沙門(mén)菌sufC功能研究
　　(1) sufC基因缺陷變異株的制備：用特異性引物擴(kuò)增帶有sufC基因上下游同源臂的卡那霉素抗性基因片段,將其電轉(zhuǎn)至含pKD46的傷寒沙門(mén)菌野生株，利用λ-Red系統(tǒng)制備sufC的基因缺陷株。
　　(2) sufC基因缺陷回補(bǔ)株的制備：構(gòu)建重組質(zhì)粒pACYC184-sufC，將其及pACYC184空質(zhì)粒

3、導(dǎo)入sufC基因缺陷株，制備sufC基因的缺陷回補(bǔ)株及空質(zhì)?；匮a(bǔ)對(duì)照株。
　　(3)生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：分別測(cè)定S. Typhi野生株、sufC基因缺陷株、sufC基因缺陷回補(bǔ)株和空質(zhì)?；匮a(bǔ)對(duì)照株在正常條件、高滲應(yīng)激、酸和氧應(yīng)激條件下的生長(zhǎng)曲線，比較各菌株的生長(zhǎng)差異。
　　(4) sufC基因缺陷株的上皮細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：將傷寒沙門(mén)菌野生株、sufC基因缺陷變異株及其回補(bǔ)株和空質(zhì)?；匮a(bǔ)對(duì)照株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD6000.4），分別

4、感染HeLa細(xì)胞（MOI均為10），分析各菌株對(duì)上皮細(xì)胞侵襲力的差異。
　　(5) sufC基因缺陷株在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存實(shí)驗(yàn)：將傷寒沙門(mén)菌野生株、sufC基因缺陷變異株及其回補(bǔ)株和空質(zhì)?；匮a(bǔ)對(duì)照株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD6000.4），分別感染THP-1巨噬細(xì)胞（MOI均為10），比較各菌株在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存能力差異，同時(shí)在細(xì)菌感染巨噬細(xì)胞的不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定上清液中巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平。
　　二、傷寒沙門(mén)菌t4606基

5、因功能研究
　　(1) t4606基因缺陷變異株的制備：構(gòu)建t4606基因缺損型同源核苷酸片段，采用自殺質(zhì)粒pGMB151介導(dǎo)的同源重組方法制備傷寒沙門(mén)菌t4606缺陷變異株。
　　(2) t4606基因缺陷回補(bǔ)株的制備：構(gòu)建重組質(zhì)粒pBAD-t4606，將其及空質(zhì)粒pBAD分別導(dǎo)入t4606基因缺陷變異株，制備sufC基因缺陷回補(bǔ)株和空質(zhì)?；匮a(bǔ)對(duì)照株。
　　(3)生長(zhǎng)曲線測(cè)定：測(cè)定S. Typhi野生株、t4606基

6、因缺陷株、t4606基因缺陷回補(bǔ)株、空質(zhì)?；匮a(bǔ)對(duì)照株在普通條件、高滲應(yīng)激、酸應(yīng)激和氧應(yīng)激條件下的生長(zhǎng)曲線，比較各菌株的生長(zhǎng)差異。
　　(4) t4606基因缺陷株的上皮細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn),方法同上述傷寒沙門(mén)菌t4606基因缺陷株的上皮細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。
　　(5) t4606基因缺陷株在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存實(shí)驗(yàn)，方法同上述傷寒沙門(mén)菌t4606基因缺陷株的胞內(nèi)生存實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　(1)經(jīng)PCR及序列分析驗(yàn)證，成功制備了傷寒

7、沙門(mén)菌sufC、t4606基因缺陷株及其回補(bǔ)株和空質(zhì)?；匮a(bǔ)對(duì)照株。
　　(2)生長(zhǎng)曲線表明，sufC缺陷株在普通條件和高滲應(yīng)激條件下與野生株的生存能力無(wú)明顯差異，而在氧應(yīng)激條件下，sufC缺陷株的生長(zhǎng)明顯遲緩于野生株，回補(bǔ)sufC基因至sufC缺陷株后，回補(bǔ)株的生長(zhǎng)恢復(fù)至野生株水平。
　　(3)與野生株相比，sufC缺陷株對(duì)上皮細(xì)胞的侵襲力明顯減弱。
　　(4)與野生株相比，sufC缺陷株在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存能力明顯減弱

8、；野生株與sufC缺陷株感染巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中均有細(xì)胞因子TNF和IL-6的表達(dá)，但在sufC缺陷株中TNF和IL-6的表達(dá)水平均明顯低于野生株。
　　(5)在普通生長(zhǎng)條件和氧應(yīng)激條件下，t4606的缺失對(duì)傷寒沙門(mén)菌的生長(zhǎng)無(wú)影響，但在高滲應(yīng)激條件下，t4606缺陷株的生長(zhǎng)明顯遲緩于野生株，回補(bǔ)t4606基因至t4606缺陷株后，回補(bǔ)株的生長(zhǎng)恢復(fù)至野生株水平。
　　(6)與野生株相比，t4606缺陷株在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存

9、能力及其對(duì)hela細(xì)胞的侵襲力無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論:
　　通過(guò)兩種細(xì)菌基因缺失制備系統(tǒng)，我們成功制備了傷寒沙門(mén)菌sufC和t4606基因缺陷株及其回補(bǔ)株和空質(zhì)?；匮a(bǔ)對(duì)照株。本研究表明，sufC基因有助于傷寒沙門(mén)菌在氧應(yīng)激環(huán)境下的生長(zhǎng)，促進(jìn)傷寒沙門(mén)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活，且明顯增強(qiáng)傷寒沙門(mén)菌對(duì)上皮細(xì)胞的侵襲力，提示sufC基因?qū)τ趥抽T(mén)菌在致病過(guò)程中的侵襲和胞內(nèi)生存兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)具有重要的促進(jìn)作用。同時(shí)，t4606基因促進(jìn)傷寒