脊髓背角P2Y13受體參與AM1241對(duì)CCI大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、神經(jīng)病理性疼痛（Neuropathic Pain, NP）在臨床上非常常見，一般是由于軀體感覺系統(tǒng)產(chǎn)生疾病或者受到損傷后，機(jī)體受到的有害或者無害的刺激被病理性放大后所致。當(dāng)外周神經(jīng)損傷后，相應(yīng)的脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞被迅速激活，通過釋放各種神經(jīng)活性物質(zhì)或一些炎癥因子，促進(jìn)了中樞痛敏的形成。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在內(nèi)源性大麻素遞質(zhì)受體系統(tǒng)。大麻素受體主要包括CB1受體（cannabinoid receptor1, CB1R）和CB2受體（canna

2、binoid receptor2, CB2R）兩種亞型，在脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)有CB2R，參與大麻素類藥物的鎮(zhèn)痛作用。此外，ATP是一種可致痛的神經(jīng)遞質(zhì)，一般通過P2X和P2Y受體發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)痛覺信息傳遞。其中，P2Y13R表達(dá)于脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞，參與了外周神經(jīng)損傷后的疼痛癥狀。大麻素CB2R激活后，是否通過下游信號(hào)通路調(diào)節(jié)P2Y13R表達(dá)或功能發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用？慢性坐骨神經(jīng)縮窄性損傷（chronic constriction inj

3、ury of the sciatic nerve，CCI）模型是基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中常用的神經(jīng)病理性疼痛模型。因此，本實(shí)驗(yàn)制作大鼠CCI疼痛模型，觀察：CCI大鼠疼痛行為學(xué)變化；鞘內(nèi)注射CB2R激動(dòng)劑AM1241對(duì)CCI大鼠痛行為學(xué)的影響；以及脊髓背角 P2Y13R、P38絲裂原活化蛋白激酶（P38-mitogen activated protein kinases， P38MAPK）磷酸化水平、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（Nuclear factorκB

4、，NF-κB）亞單位p65表達(dá)的影響；鞘內(nèi)注射P38MAPK磷酸化抑制劑SB203580、NF-κB信號(hào)抑制劑PDTC對(duì)CCI大鼠疼痛行為學(xué)及P2Y13R表達(dá)的影響；鞘內(nèi)注射AM1241、SB203580、PDTC對(duì)ADPβS處理組大鼠P2Y13R表達(dá)的影響。該實(shí)驗(yàn)為深入理解 CB2R激活后發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制研究提供新思路，為以CB2R為靶點(diǎn)的鎮(zhèn)痛藥物研究提供理論基礎(chǔ)。
　　目的：⑴明確脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞P2Y13R是否參與AM1

5、241對(duì)CCI大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。⑵明確大麻素CB2R激活后是否通過抑制P38MAPK磷酸化或NF-κB活性下調(diào)P2Y13R表達(dá)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。
　　方法：①健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組（n=8）:假手術(shù)組(Sham組)、CCI模型組(鞘內(nèi)注射0.005％DMSO生理鹽水)、AM1241干預(yù)組(CB2R激動(dòng)劑，100pM)。各組大鼠均需鞘內(nèi)置管。假手術(shù)組大鼠僅暴露坐骨神經(jīng)不進(jìn)行結(jié)扎。鞘內(nèi)置管7d后結(jié)扎坐骨神經(jīng),連續(xù)14d鞘內(nèi)注射0.

6、005%DMSO生理鹽水或AM124110μl，2次/d，在術(shù)前1d，術(shù)后第1，3，5，7，10，14d測定給藥1.5h后各組大鼠的熱縮足潛伏期（thermal withdrawal latency，TWL）；分別在第3、7和14d處死大鼠，取結(jié)扎側(cè)脊髓（L4-6）背角，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR， RTFQ-PCR）和免疫印跡（Western Blot，WB）技術(shù)檢

7、測P2Y13R表達(dá)，WB技術(shù)檢測p-P38MAPK、NF-κBp65表達(dá)水平。②健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組（n=8）:假手術(shù)組(Sham組)、CCI模型組(鞘內(nèi)注射0.005%DMSO生理鹽水)、SB203580（50μM）干預(yù)組、PDTC(5μg/10μl)干預(yù)組。假手術(shù)組大鼠僅暴露坐骨神經(jīng)不進(jìn)行結(jié)扎。其余組大鼠均于鞘內(nèi)置管7d之后結(jié)扎坐骨神經(jīng)并給藥，連續(xù)7d，2次/d，分別在第7d處死大鼠，取術(shù)側(cè)脊髓（L4-6）背角，應(yīng)用RT

8、FQ-PCR和WB技術(shù)檢測脊髓背角P2Y13R表達(dá)。③健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組（n=8）:正常組(normal組，鞘內(nèi)注射0.01M PBS)、ADPβS處理組(鞘內(nèi)注射100μM ADPβS10μL1h后注射生理鹽水10μL)、SB203580干預(yù)組（鞘內(nèi)注射50μM SB20358010μL1h后注射100μM ADPβS10μL）、PDTC干預(yù)組(鞘內(nèi)注射5μg/10μl PDTC10μL1h后注射100μM ADPβS1

9、0μL)。除正常組外，其余各組大鼠均于鞘內(nèi)置管7d之后給藥，連續(xù)7d，2次/d，分別在第7d處死大鼠，取術(shù)側(cè)脊髓（L4-6）背角，應(yīng)用RTFQ-PCR和WB技術(shù)檢測脊髓背角P2Y13R表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴大鼠CCI術(shù)后1d即出現(xiàn)穩(wěn)定的熱痛敏，與sham組相比，CCI模型組大鼠在術(shù)后1d即出現(xiàn)TWL明顯下降，持續(xù)14d處于低水平；與CCI模型組相比，AM1241干預(yù)組大鼠在術(shù)后第1，3，5，7，10，14d TWL延長明顯。RTFQ

10、-PCR和WB結(jié)果顯示，與sham組相比，CCI模型組大鼠脊髓背角P2Y13R mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平在第3d即開始上升，第7d進(jìn)一步上升，第14d雖有所下降，但仍然維高水平；與CCI模型組相比，AM1241干預(yù)組大鼠第3，7，14d P2Y13R在mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)。⑵與sham組相比，CCI模型組大鼠在第3,7d脊髓背角p-P38MAPK及NF-κBp65蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)；與 CCI模型組相比， AM12

11、41干預(yù)組大鼠第3，7d p-P38MAPK和 NF-κBp65蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)。⑶與CCI模型組相比，SB203580干預(yù)組和PDTC干預(yù)組大鼠在術(shù)后第1，3，5，7，10，14d TWL均延長明顯。與CCI模型組相比，SB203580干預(yù)組和PDTC干預(yù)組大鼠第7d P2Y13R在 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)。⑷與正常組相比，ADPβS處理組大鼠在給藥后3d即出現(xiàn)TWL明顯下降，持續(xù)至第7d均處于低水平；與ADPβS處理

12、組大鼠相比，AM1241干預(yù)組、SB203580干預(yù)組、PDTC干預(yù)組大鼠在給藥后第3，5，7d TWL均延長明顯。與正常組相比，ADPβS處理組大鼠第7d，P2Y13R在 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)；與ADPβS處理組大鼠相比，AM1241干預(yù)組、SB203580干預(yù)組、PDTC干預(yù)組大鼠P2Y13R在mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)。
　　結(jié)論：①脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞P2Y13R參與AM1241對(duì)CCI大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。②C