梓醇對H-,2-O-,2-誘導(dǎo)HUVECs和H9c2細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、凋亡在眾多的病理生理過程中起著重要的作用。細(xì)胞生長和凋亡之間的平衡決定著許多病理生理過程,如高血壓,動脈粥樣硬化,血管疾病的發(fā)生發(fā)展。在動脈粥樣硬化形成過程中過多的活性氧的產(chǎn)生加速了動脈粥樣硬化,最終導(dǎo)致了心血管疾病的發(fā)生。
　　 H202是體內(nèi)氧化代謝的產(chǎn)物,也是一種活性氧,它不僅能直接氧化細(xì)胞膜上的脂質(zhì)及蛋白,而且能自由穿過細(xì)胞膜,導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和細(xì)胞內(nèi)DNA的損傷。H2O2還可以通過降低細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

2、進(jìn)一步的研究表明H2O2刺激線粒體釋放細(xì)胞色素C(Cytochrome C,Cyt-C),引起細(xì)胞結(jié)構(gòu),功能,代謝的改變,進(jìn)而引起血管疾病的發(fā)生。
　　 梓醇(catalpol)是一種環(huán)烯醚萜葡萄糖苷類化合物,在神經(jīng)細(xì)胞及其他細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)它具有抗凋亡的作用。體外實驗發(fā)現(xiàn)梓醇能抑制H2O2誘導(dǎo)PCl2細(xì)胞凋亡,激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)分化。梓醇對心血管氧化應(yīng)激的作用還未有報道,但有研究表明梓醇能抑制腦缺血再灌注動物模型中的

3、氧化應(yīng)激,在外周組織如腎臟中,梓醇也具有保護(hù)作用。因此,我們很有理由去研究梓醇是否也能對抗心血管疾病中的氧化應(yīng)激損傷。
　　 Akt信號途徑是細(xì)胞重要的促增殖、遷移及存活信號途徑。多種生長因子均可通過PI3K途徑激活A(yù)kt/PKB。完全活化的Akt通過磷酸化和鈍化其下游底物,經(jīng)由多種途徑而促進(jìn)細(xì)胞的存活。例如胞質(zhì)內(nèi)Bad能被Akt磷酸化,磷酸化后的Bad不能轉(zhuǎn)位進(jìn)入線粒體,抑制Cyt-C釋放入胞質(zhì),減少caspase-3活化,進(jìn)

4、而抑制細(xì)胞凋亡。根據(jù)功能可將Bcl-2基因家族分為兩類:一類是抗凋亡的,如Bcl-2、Bcl-XL；一類是促凋亡的,如Bax、Bad等。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),位于線粒體外膜的Bcl-2家族蛋白,能通過改變線粒體細(xì)胞膜的通透性,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 本實驗觀察了在離體細(xì)胞給予梓醇治療是否可以減輕H2O2損傷導(dǎo)致內(nèi)皮及心肌細(xì)胞凋亡以及分析了梓醇抗血管內(nèi)皮及心肌細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,尤其是梓醇的這種保護(hù)作用是否是部分通過激活傳導(dǎo)通路P

5、I3K/Akt,調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)而實現(xiàn)的。
　　 材料與方法：
　　 (1)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,H9c2細(xì)胞培養(yǎng),梓醇和/或H2O2共同孵育,收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液；分別加入PI3K的特異性抑制劑wortmannin及LY294002進(jìn)行干預(yù),收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液,用于指標(biāo)檢測。
　　 (2)采用MTT法檢測梓醇對HUVECs及H9c2細(xì)胞存活率的影響。
　　 (3)應(yīng)用LDH,SOD,MDA檢測

6、試劑盒檢測細(xì)胞LDH,SOD,MDA的活性。
　　 (4)采用激光共聚焦法檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的濃度。
　　 (5)應(yīng)用Annexin V-FITC、TUNEL和hoechst 33258試劑盒檢測細(xì)胞的凋亡。
　　 (6)采用western blotting法檢測HUVECs及H9c2細(xì)胞Akt、p-Akt、p-Bad、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)。
　　 (7)采用real time RT-PC

7、R法檢測內(nèi)皮細(xì)胞Akt、Bad、Bcl-2及Bax mRNA的表達(dá)。
　　 (8)采用免疫組化法檢測心肌細(xì)胞p-Akt、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)。
　　 (9)各實驗組數(shù)據(jù)均用(x)±s表示,利用spss11.5統(tǒng)計軟件分析,組間差異比較采用單因素方差分析。P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)果：
　　 (1)Catalpol終濃度為0.1～10μg/ml時可促進(jìn)細(xì)胞存活,呈劑量依賴性。但catal

8、pol終濃度高至1000μg/ml時則出現(xiàn)增殖抑制效應(yīng)。
　　 (2)10μg/ml catalpol處理0h、24h、48h、72h,較對照組細(xì)胞存活率明顯升高。Catalpol作用72h時,HUVECs存活率達(dá)峰值；梓醇作用48h時,H9c2存活率達(dá)峰值。
　　 (3)不同濃度0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml catalpol預(yù)處理可以減輕H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷,隨著catalpol濃度的增加,相應(yīng)的M

9、TT檢測的OD值也隨之增加。
　　 (4)H2O2組在H2O2作用后內(nèi)皮及心肌細(xì)胞受到損傷,LDH較C組明顯增高,損傷后MDA亦較C組明顯增高,SOD較C組明顯降低(均P<0.05)。Catalpol(0.1～10μg/ml)預(yù)處理培養(yǎng)細(xì)胞,在H2O2損傷過程中,均較H2O2組細(xì)胞損傷小,LDH和MDA含量明顯減少,而SOD則較H2O2組明顯增加。
　　 (5)經(jīng)H2O2處理24h后,細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),用不同的濃度

10、catalpol(0.1～10μg/ml)預(yù)處理24h后,與H2O2組相比細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯下降為,呈濃度依賴性。
　　 (6)內(nèi)皮細(xì)胞C組可見少許的TUNEL陽性細(xì)胞。與C組相比,細(xì)胞在H2O2(100μmol/L)中培養(yǎng)24h明顯增加TUNEL,陽性細(xì)胞數(shù),然而,當(dāng)用catalpol(0.1～10μg/ml)預(yù)處理24h后加入H2o2(100μmol/L)作用24h,凋亡率明顯下降,且隨著catalpol劑量增加凋亡率降低。

11、
　　 (7)正常的心肌細(xì)胞核呈圓形或橢圓形,染色均勻,呈正常的藍(lán)色,而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核有明顯的染色質(zhì)邊聚呈致密濃染,或呈碎塊狀致密濃染,變形亮度增強(qiáng),顏色發(fā)白。Hoechst 33258結(jié)果顯示:C組細(xì)胞少見白色亮點,H2O2組細(xì)胞見大量凋亡細(xì)胞。經(jīng)不同濃度catalpol處理后,白色亮點呈逐漸減少趨勢,凋亡細(xì)胞明顯減低,呈劑量相關(guān)性。
　　 (8)Annexin-FITC/PI檢測內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率顯示C組細(xì)胞的存活率為

12、78.7±1.2％；而H2O2(100μmol/L)組細(xì)胞的凋亡率顯著升高,凋亡率為35.9±0.6％,說明H2O2誘導(dǎo)了內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。用不同濃度的catalpol(0.1、1、10μg/ml)預(yù)處理各組細(xì)胞后再施以H2O2作用,細(xì)胞的凋亡率出現(xiàn)不同程度的下降,而且隨著catalpol濃度的升高,各組細(xì)胞的凋亡率也隨之依次下降,細(xì)胞凋亡率分別降低至27.6±0.6％,22.6±0.8％和19.1±0.4％。
　　 H2O2組心

13、肌細(xì)胞凋亡率明顯高于C組(P<0.01)；與H2O2組比較,catalpoll、catalpol2、catalpol3組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.01),且隨著catalpol劑量增加凋亡率降低。
　　 (9)Western blotting結(jié)果顯示:H2O2作用24h后,Akt在各組中都有表達(dá),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),p-Akt,p-Bad,Bcl-2蛋白表達(dá)量較C組明顯減少,Bax蛋白表達(dá)較C組明顯增加,差異具有

14、顯著性(P<0.01)。Catalpol 0.1,0,10μg/ml可以劑量依賴性地增加p-Akt,p-Bad,Bcl-2蛋白表達(dá),降低Bax蛋白的表達(dá),與H2O2組比較差均有顯著性(P<0.05,P<0.01)。Wortmannin和LY294002預(yù)處理可拮抗catalpol部分保護(hù)作用。
　　 免疫組化結(jié)果顯示,在光鏡下,心肌細(xì)胞陽性表達(dá)的p-Akt,Bcl-2,Bax蛋白主要積聚在胞漿中,呈棕色反應(yīng),各組蛋白表達(dá)強(qiáng)度不一

15、致。積分光密度值檢測結(jié)果顯示,與C組比較,H2O2組細(xì)胞p-Akt,Bcl-2蛋白表達(dá)減弱(P<0.05,P<0.01),Bax蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01)；與H2O2組比較,catalpolt、catalpol2、catalpol3組細(xì)胞的p-Akt,Bcl-2蛋白表達(dá)增高(P<0.01),Bax蛋白表達(dá)顯著減弱(P<0.01)。Wortmannin和LY294002可拮抗catalpol部分保護(hù)作用。
　　 (10)Re

16、al time RT-PCR結(jié)果顯示:H2O2作用24h后,Akt,Bad,Bcl-2 mRNA表達(dá)量較C組明顯減少,Bax mRNA表達(dá)較C組明顯增加。Catalpol 0.1,1,10μg/ml可以劑量依賴性地增加Akt,Bad,Bcl-2 mRNA表達(dá),降低Bax mRNA的表達(dá),與H202組比較差均有顯著性(P<0.05,P<0.01)。Wortmannin和LY294002預(yù)處理可拮抗catalpol部分保護(hù)作用。
　　

17、 結(jié)論：
　　 (1)Catalpol對HUVECs、H9c2細(xì)胞存活率的影響具有時間和劑量依賴性。
　　 (2)Catalpol通過降低MDA,增加SOD減輕H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。
　　 (3)Catalpol可能通過清除細(xì)胞內(nèi)過多的ROS來參與H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)。
　　 (4)PI3K/Akt-Bad途徑可能為catalpol抗H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 (5)