長-短鏈TSLP在屋塵螨誘導的哮喘氣道上皮屏障破壞中的作用機制研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　哮喘是一種常見的氣道慢性非特異性炎癥性疾病，近年來由于人們生活環(huán)境的改變，在全球范圍內(nèi)哮喘的發(fā)病率和病死率明顯增加，在全世界已影響了近3億人。氣道上皮細胞是機體和環(huán)境之間的第一道防線，它的主要功能是作為物理屏障抵御外部環(huán)境中微生物，氣體和過敏原等的侵襲。而氣道上皮細胞的物理屏障功能是依賴于細胞的完整性和細胞間連接蛋白的相互作用。我們的課題組前期研究已證明屋塵螨可以破壞氣道上皮屏障功能，而如何改善過敏原所致的氣

2、道上皮的損傷已經(jīng)成為哮喘防治研究的關注重點。
　　研究表明胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(TSLP)在哮喘的預防和治療中扮演重要的角色。新近研究發(fā)現(xiàn)TSLP有不同的兩個亞型即長鏈TSLP(lfTSLP)及短鏈TSLP(sfTSLP)，近年來有關sfTSLP和lfTSLP的不同作用已引起了關注，然而，sfTSLP和lfTSLP在哮喘中是否也發(fā)揮著不同的作用，現(xiàn)在尚未見到報道。
　　針對上述問題，本課題擬在體內(nèi)和體外實驗探討:
　

3、　1.lfTSLP是否促進了HDM誘導的氣道上皮屏障破壞？
　　2.合成的sfTSLP是否可以保護HDM誘導的氣道上皮屏障破壞？
　　3.進一步明確在HDM所導致的哮喘性氣道上皮屏障破壞中，lfTSLP發(fā)揮破壞作用和sfTSLP發(fā)揮保護作用的可能機制。
　　研究方法
　　1.體外實驗:
　　1.1.人正常支氣管上皮細胞系(16HBE)的培養(yǎng)。
　　1.2.使用Western blot、RT-PCR、T

4、ER、FITC和免疫熒光檢測不同時間點及不同濃度的HDM對16HBE細胞的影響。
　　1.3.使用RT-PCR、TER、FITC和免疫熒光檢測1α，25-Dihydroxyvitamin D3(1，25D3)對細胞sfTSLP表達及HDM導致的氣道上皮細胞屏障的破壞的影響。
　　1.4.使用Western blot檢測HDM是否通過MAPK通路引起lfTSLP的增高。
　　1.5.使用Western blot、TER、

5、FITC和免疫熒光檢測lfTSLP對氣道上皮細胞屏障的直接影響及STAT5信號通路在這個過程中的作用。
　　1.6.使用Western blot、TER、FITC和免疫熒光檢測sfTSLP對HDM和lfTSLP誘導的氣道上皮屏障的破壞的影響。
　　2.體內(nèi)實驗:
　　2.1.BALB/c小鼠60只，隨機分為:(1)control(2)1，25D3(3) sfTSLP(4) HDM(5)1,25D3+HDM(6)sfTS

6、LP+HDM。所有小鼠每周連續(xù)5天進行相應處理，進行8周。
　　2.2.小鼠完成最后一次操作24小時后進行動物無創(chuàng)肺功能檢測小鼠氣道反應性，收集血清使用ELISA檢測IgE;收集小鼠的肺泡灌洗液檢測IFN-γ、 IL-4、IL-5、IL-13、IL-33、TSLP(lfTSLP)。
　　2.3.取出小鼠左肺進行HE染色和E-cadherin、β-catenin和lfTSLP的免疫組織化學染色;取出小鼠右肺組織提取全肺蛋白，使

7、用Western blot檢測目的蛋白。
　　3.應用SPSS19.0分析數(shù)據(jù)。
　　研究結果:
　　1.在16HBE細胞中，HDM上調(diào)lfTSLP的表達和破壞氣道上皮屏障。
　　2.在16HBE細胞中，1，25D3上調(diào)sfTSLP的表達和抑制了HDM所導致的氣道上皮屏障的破壞。
　　3.在16HBE細胞中，HDM通過激活MAPK信號通路導致lfTSLP的上調(diào)。
　　4.在16HBE細胞中，lfTSL

8、P通過激活STAT5信號通路破壞氣道上皮屏障。
　　5.在16HBE細胞中，sfTSLP可以保護HDM和lfTSLP導致的氣道上皮屏障的破壞。
　　6.在HDM導致的哮喘小鼠模型中，1，25D3和sfTSLP通過抑制ERK和p38信號通路來保護HDM所致的氣道炎癥和氣道屏障蛋白的破壞。
　　研究結論:
　　1.HDM可通過ERK和p38信號通路的磷酸化促進lfTSLP的表達，而高表達的lfTSLP可通過激活STA