GSK3β在TNAP缺乏導(dǎo)致的牙硬組織礦化異常中的作用.pdf

1、低堿性磷酸酯酶癥（Hypophosphatasia，HPP）是一種罕見的系統(tǒng)性遺傳疾病。主要由于 ALPL基因突變導(dǎo)致組織非特異性堿性磷酸酶（TNAP）活性降低從而引起骨和牙礦化代謝的異常。TNAP在骨與牙等硬組織的礦化過程中具有重要作用。最新研究表明，TNAP缺乏不僅僅會直接抑制礦化過程，還可能通過微環(huán)境影響相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。間充質(zhì)干細(xì)胞及其微環(huán)境是維持相關(guān)組織正常發(fā)育的重要基礎(chǔ)，且在組織更新和修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用。在

2、基因缺陷情況下干細(xì)胞表現(xiàn)出的細(xì)胞生物學(xué)行為將直接關(guān)系到患者的臨床表現(xiàn)。
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，來源于HPP患兒的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSC）存在分化能力異常，同時(shí)Active-β-catenin表達(dá)降低，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路可能參與了低ALP活性條件下干細(xì)胞功能的改變。但與牙齒發(fā)育礦化密切相關(guān)的牙髓干細(xì)胞（DPSC）及牙周膜干細(xì)胞(PDLSC)，其在ALPL基因異常情況下功能的改變尚未見報(bào)道。
　　本

3、實(shí)驗(yàn)擬研究DPSC和PDLSC在TNAP缺乏時(shí)的功能改變以及相關(guān)機(jī)制，在此基礎(chǔ)上，初步探索利用恢復(fù)干細(xì)胞功能來治療HPP相關(guān)異常的可能性。
　　研究主要由以下幾個(gè)方面逐步進(jìn)行：第一，以ALPL基因敲除小鼠Akp2+/-為模型，觀察敲除 ALPL基因?qū)ρ例X硬組織的影響；第二，通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法敲減正常人來源的hPDLSC與hDPSC中的ALPL基因，觀察敲減ALPL基因?qū)Ω杉?xì)胞功能的影響，同時(shí)檢測GSK3β及相關(guān)信號通路的變化；第

4、三，觀察GSK3β磷酸化抑制劑LiCl對ALPL基因敲減后hPDLSC與hDPSC功能的影響；第四，觀察 LiCl對 Akp2+/-小鼠牙及牙槽骨異常的恢復(fù)作用，以此驗(yàn)證 GSK3β及間充質(zhì)干細(xì)胞在TNAP功能異常導(dǎo)致的牙硬組織礦化異常中的作用。
　　第一部分 ALPL基因敲除對小鼠牙硬組織的影響
　　研究目的：
　　觀察ALPL基因敲除對小鼠牙及牙槽骨的影響。
　　研究方法：
　?。?）Micro-CT掃

5、描野生型與Akp2+/-小鼠單側(cè)下頜骨，觀察Akp2+/-小鼠牙及牙槽骨的改變；選取第一磨牙冠部牙本質(zhì)進(jìn)行組織礦化密度定量分析。
　?。?）掃描電鏡觀察野生型與Akp2+/-小鼠牙本質(zhì)的礦化情況。
　　研究結(jié)果：
　?。?）Micro-CT觀察，比較于野生型，Akp2+/-小鼠的頜骨及牙槽骨存在明顯缺損，牙齒牙髓腔擴(kuò)大；
　　（2）電鏡掃描結(jié)果可見，與野生型比較，Akp2+/-小鼠牙本質(zhì)礦化程度低，可見膠原纖維暴

6、露。
　　結(jié)論：
　　相比較于野生型小鼠，Akp2+/-小鼠存在不同程度的牙槽骨缺損以及牙本質(zhì)礦化不全。
　　第二部分 ALPL基因敲減對hPDLSC與hDPSC干細(xì)胞功能的影響
　　研究目的：
　　驗(yàn)證ALPL基因突變對hPDLSC和hDPSC干細(xì)胞功能的影響。
　　研究方法：
　?。?）體外培養(yǎng)正常人來源 hPDLSC與 hDPSC，通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法敲減hPDLSC和hDPSC中的ALP

7、L基因；在此基礎(chǔ)上用Western-Blot和茜素紅染色法檢測敲減后hPDLSC和hDPSC成骨能力的改變；
　　（2）Western-Blot檢測敲減后hPDLSC與hDPSC中的P-GSK3β表達(dá)。
　　研究結(jié)果：
　　（1）Western-Blot結(jié)果可見，ALPL敲減后，hPDLSC與hDPSC中ALP蛋白表達(dá)量下降，其它成骨相關(guān)蛋白表達(dá)均下降；hDPSC中DSP表達(dá)下降。
　?。?）敲減ALPL后，茜素

8、紅染色結(jié)果可見hPDLSC與hDPSC成骨能力下降。
　?。?）敲減ALPL后，Western-Blot結(jié)果可見hPDLSC與hDPSC中P-GSK3β表達(dá)量下降。
　　結(jié)論：
　?。?）通過慢病毒轉(zhuǎn)染法可以有效地敲減hPDLSC與hDPSC中的ALPL基因，并且在敲減后，hPDLSC與hDPSC的成骨能力受到抑制；
　?。?）在敲減ALPL后，hPDLSC與hDPSC中P-GSK3β表達(dá)下降，提示W(wǎng)nt信號通路

9、受到抑制。
　　第三部分 GSK3β抑制劑對ALPL敲減hPDLSC與hDPSC功能的影響
　　研究目的：
　　觀察LiCl對ALPL敲減hPDLSC與hDPSC成骨能力的影響，驗(yàn)證GSK3β在ALPL基因突變導(dǎo)致的干細(xì)胞功能異常中的作用。
　　研究方法
　　成骨誘導(dǎo)ALPL敲減后的hPDLSC和hDPSC，在誘導(dǎo)過程中加入GSK3β抑制劑LiCl；成骨誘導(dǎo)21d時(shí)，茜素紅染色觀察其成骨能力的改變。

10、　　研究結(jié)果：
　　茜素紅染色結(jié)果可見，在成骨誘導(dǎo)過程中加入LiCl后，hPDLSC與hDPSC成骨能力明顯提高。
　　結(jié)論：
　　在成骨誘導(dǎo)過程中通過抑制GSK3β而激活 Wnt信號通路，可以使 ALPL敲減hPDLSC和hDPSC的成骨能力提高，驗(yàn)證了ALPL基因突變是通過GSK3β影響干細(xì)胞的成骨能力。
　　第四部分GSK3β抑制劑對于Akp2+/-小鼠牙硬組織異常的作用
　　研究目的：
　　觀

11、察LiCl對Akp2+/-小鼠牙硬組織異常的作用
　　研究方法：
　　對Akp2+/-小鼠注射LiCl（100mg/Kg），與Akp2+/-小鼠作比較，應(yīng)用Micro-CT和掃描電鏡觀察注射后牙槽骨缺損以及牙本質(zhì)礦化程度的變化。
　　研究結(jié)果：
　　（1）Micro-CT結(jié)果可見，比較與對照組，注射組小鼠牙槽骨缺損得到明顯改善；
　?。?）掃描電鏡觀察，注射組小鼠牙本質(zhì)礦化程度明顯升高。
　　結(jié)論：<