日本血吸蟲感染C57BL-6小鼠后B10細胞的免疫學特性研究.pdf

1、血吸蟲病是由血吸蟲感染引起的一種人獸共患寄生蟲病，調(diào)節(jié)性B細胞(Bregs)是一類具有免疫負向調(diào)節(jié)作用的B細胞亞群，通過分泌IL-10、TGF-β等細胞因子，在自身免疫病、慢性炎癥、腫瘤及寄生蟲感染等疾病中發(fā)揮著免疫抑制作用。近年來研究表明，曼氏血吸蟲感染后可以誘導高分泌IL-10的Bregs(B10細胞)產(chǎn)生，并且在抑制自身免疫病過程中發(fā)揮重要的作用。課題組在前期工作中已經(jīng)證實日本血吸蟲蟲卵抗原(SEA)在體內(nèi)、體外均可以誘導產(chǎn)生B1

2、0細胞，然而，在血吸蟲感染不同階段B10細胞的動態(tài)變化及其表型仍不明確，B10細胞對其他細胞的免疫調(diào)控作用仍不清楚。此外，日本血吸蟲感染誘導B10細胞活化的機制尚不明確。因此，我們對日本血吸蟲感染C57BL/6小鼠后B10細胞的免疫學特性進行了研究。
　　研究內(nèi)容分為3部分:
　　1.日本血吸蟲感染不同階段B10細胞的動態(tài)變化
　　目的:通過體內(nèi)動物實驗觀察血吸蟲感染的不同階段B10細胞的動態(tài)變化。
　　方法:構(gòu)

3、建日本血吸蟲感染C57BL/6小鼠的模型，分別在感染0w、3w、6w、13w，ELISA檢測血清中SEA特異性抗體IgG、IgG1和IgG2a的變化，ELISA法檢測血清IL-10以及脾臟CD19＋B細胞體外培養(yǎng)上清中IL-10、IL-4、IFN-γ的水平，同時流式檢測脾臟中CD19＋IL-10＋B細胞的比例。感染13w時通過胸主動脈灌注得到成蟲，KOH消化肝臟后顯微鏡下計數(shù)蟲卵，計算每對成蟲產(chǎn)卵個數(shù)，同時鏡下觀察感染各時期肝臟的病理改

4、變。
　　結(jié)果:小鼠血清中，可溶性蟲卵抗原(SEA)特異性IgG、IgG1、IgG2a抗體水平顯著增高。日本血吸蟲感染后的第6w和第13w，脾臟B細胞分泌的IL-10水平也顯著升高，IFN-γ以及IL-4水平無明顯改變。同時，感染后6w和13w，B10細胞比例也顯著增多。感染后第13w，可收集到成蟲，肝臟有沉積蟲卵和蟲卵肉芽腫的形成。
　　結(jié)論:在日本血吸蟲感染急性和慢性期，日本血吸蟲可以誘導小鼠脾臟產(chǎn)生B10細胞。

5、　　2.日本血吸蟲感染誘導產(chǎn)生的B10細胞的表型和功能
　　目的:探索血吸蟲感染過程中B10細胞的表型和功能。
　　方法:感染第13w磁珠分離小鼠脾臟CD19＋B細胞，標記表面抗體，流式檢測CD19＋CD1d＋CD5＋以及CD19＋Tim-1＋兩種B10細胞的比例，然后根據(jù)表型流式分選細胞，體外培養(yǎng)后檢測上清中IL-10水平，明確分泌IL-10的B細胞表型。根據(jù)表型流式分選B10細胞然后與磁珠分選出的CD4＋T細胞共孵育，同

6、時加入抗CD3抗體和抗CD28抗體，72h后，ELISA法檢測細胞上清中IL-4、IFN-γ以及IL-17的水平。
　　結(jié)果:CD19＋Tim-1＋B細胞高分泌IL-10，并且這群細胞能夠誘導活化的CD4＋T細胞分泌IL-4，并抑制IL-17的分泌。
　　結(jié)論:在日本血吸蟲感染過程中，CD19＋Tim-1＋B細胞可以對Th2和Th17細胞產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。
　　3.日本血吸蟲誘導B10細胞活化機制的初步探討
　　目的

7、:研究日本血吸蟲誘導B10細胞活化的機制。
　　方法:體外用SEA、LPS分別刺激正常小鼠CD19＋B細胞，通過實時熒光定量PCR方法檢測CD19＋B細胞TLR2、TLR4以及IL-10的mRNA水平。磁珠分選正常小鼠和TLR4-/-小鼠脾臟CD19＋B細胞，SEA、LPS分別刺激72h后，流式檢測IL-10＋B細胞的比例，同時ELISA檢測上清中IL-10的水平。
　　結(jié)果:SEA和LPS刺激后，CD19＋B細胞TLR4以

8、及IL-10的mRNA的表達水平明顯升高;TLR4-/-小鼠CD19＋B細胞在SEA和LPS刺激后，IL-10＋B細胞比例以及分泌IL-10的量顯著低于正常小鼠。
　　結(jié)論:SEA誘導產(chǎn)生B10細胞部分依賴于TLR4途徑。
　　通過小鼠體內(nèi)、外實驗，對日本血吸蟲感染過程中B10細胞動態(tài)變化、表型、功能以及誘導B10細胞活化的機制的研究，有助于我們進一步了解日本血吸蟲感染過程中的免疫調(diào)控機制，同時為探索血吸蟲感染疫苗研制提供了