CD4+NKG2D+T細胞在NOD鼠T1D中的作用機制研究.pdf

1、Ⅰ型糖尿病(type1 diabetes mellitus，T1D)是一種自身反應性T細胞攻擊自身胰島β細胞使其受損的一種自身免疫性疾病。它主要是以效應性的CD4+T細胞和CD8+T細胞為主導，其他多種免疫細胞共同參與而形成的。NKG2D為NK細胞活化性受體，近來研究發(fā)現(xiàn)亦可表達于人NKT，γδT，激活的巨噬細胞，CD4+T細胞亞群，CD8+T細胞;鼠的NKT，γδT細胞亞群，激活的CD8+T細胞，CD4+T細胞亞群。
　　有研究

2、表明，Ⅰ型糖尿病的動物模型NOD鼠的胰島β細胞表達NKG2D的配體Rae-1，因此產(chǎn)生了大量表達NKG2D受體的自身反應性CD8+T、CD4+T細胞浸潤在胰島中。為進一步探討CD4+NKG2D+T細胞參與NOD鼠T1D的發(fā)病機制，本課題對發(fā)病前驅(qū)期，發(fā)病期以及免疫干預后的NOD鼠外周血中該群細胞的表型特征、功能及活化狀態(tài)進行研究。本研究內(nèi)容分為三部分:
　　第一部分:NOD鼠CD4+NKG2D+T細胞頻率與Ⅰ型糖尿病疾病進程正相關

3、
　　目的:觀察NOD鼠體內(nèi)CD4+NKG2D+T細胞在Ⅰ型糖尿病疾病進程中頻率變化，探索NOD鼠體內(nèi)該群細胞與CD8+T細胞間關系。
　　方法:動態(tài)監(jiān)測NOD鼠(n=24)、Ba1b/c鼠(n=24)外周血中CD4+NKG2D+T及CD8+NKG2D+T細胞在不同周齡的頻率。進而利用可有效降低血糖及發(fā)病率的偶聯(lián)皂草素IGRP206-214dtSCT四聚體體內(nèi)靶向清除抗原特異性清除CTL的NOD鼠(n=12)，對其CD4+N

4、KG2D+/CD4+T及CD8+NKG2D+/CD8+T細胞頻率進行分析。將所得各個周齡CD4+NKG2D+T及CD8+NKG2D+T細胞頻率做線性回歸分析。
　　結果:NOD鼠外周血CD4+NKG2D+/CD4+T及CD8+NKG2D+/CD8+T細胞頻率隨著T1D疾病進程發(fā)展而顯著升高。而同周齡的Ba1b/c鼠外周血中的CD4+NKG2D+/CD4+T及CD8+NKG2D+/CD8+T細胞頻率幾乎無變化。偶聯(lián)皂草素體內(nèi)特異性C

5、TL清除的NOD鼠外周血CD4+NKG2D+/CD4+T細胞頻率隨著CD8+NKG2D+/CD8+T細胞頻率降低而降低，并且二者之間呈正相關。
　　結論:NOD鼠體內(nèi)存在著一群與Ⅰ型糖尿病相關的頻率增高的CD4+NKG2D+T細胞，并且該群細胞與其體內(nèi)的CD8+T細胞之間呈正相關。
　　第二部分:NOD鼠體內(nèi)CD4+NKG2D+T細胞生物學特性分析
　　目的:分析并對比處于Ⅰ型糖尿病發(fā)病前驅(qū)期以及發(fā)病期NOD鼠體內(nèi)CD

6、4+NKG2D+T細胞的功能特性、表型特征、活化狀態(tài)。在體外初步探究該群細胞與CD8+T細胞之間的相互作用關系。
　　方法:通過流式細胞術分別檢測處于發(fā)病前驅(qū)期(n=18)及發(fā)病期(n=18)的NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T細胞表面CD107A、FasL、CD44、CD62L、CD69、CD25表達情況，以及胞內(nèi)染色法分析IFN-γ、RORγt、IL-17A、Perforin、granzyme B、TGF-β、IL-10分

7、泌情況。比較NOD鼠體內(nèi)該群細胞處于Ⅰ型糖尿病兩種不同疾病階段，CD4+NKG2D+T細胞功能、表型特點及活化狀態(tài)的差異。采用磁珠分選的方法獲取純凈的CD4+NKG2D+T、CD4+NKG2D-T以及CD8+T細胞，將所得的發(fā)病前驅(qū)期NOD鼠脾臟中的CD4+NKG2D+T細胞分別與經(jīng)CFSE標記的CD4+NKG2DT細胞、CD8+T細胞共培養(yǎng)。4天后檢測體系中的CD4+NKG2D-T細胞、CD8+T細胞CFSE的熒光強度變化情況。

8、>　　結果:發(fā)病期NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T細胞IFN-γ分泌較發(fā)病前驅(qū)期無變化。RORγt的表達較發(fā)病前驅(qū)期顯著上升，IL-17A的分泌水平亦升高。代表細胞毒活性的CD107A、顆粒酶B(granzyme B)和穿孔素(Perforin)均無明顯變化。發(fā)病期NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T細胞表達FasL頻率較發(fā)病前驅(qū)期稍有上升但變化不明顯，TGF-β和IL-10亦是稍有升高，但個體差異比較大的原因使得它們之間沒有統(tǒng)

9、計學意義。發(fā)病期的NOD鼠外周血中的該群細胞較CD4+NKG2D-T細胞，效應記憶性T細胞的頻率較多，而中樞記憶性T細胞與CD4+NKG2D-T細胞相比則略有提升，二者之間初始T細胞頻率雖稍有上升但亦無統(tǒng)計學差異。發(fā)病期的NOD鼠外周血中的該群細胞較CD4+NKG2D-T細胞，CD69表達頻率升高，CD25表達頻率亦顯著上升。將磁珠分選所得的CD4+NKG2D+T和CD4+NKG2D-T細胞共培養(yǎng)4天，與單獨的CD4+NKG2D-T細胞

10、相比，加入CD4+NKG2D+T細胞的培養(yǎng)體系中，其CD4+NKG2D-T細胞的增殖加快。而CD8+T的增殖則無變化。
　　結論:NOD鼠從Ⅰ型糖尿病發(fā)病前驅(qū)期至發(fā)病期之間，其外周血中的CD4+NKG2D+T細胞不僅頻率有所提高，而且該群細胞的活化程度也有一定幅度的增強，當達到發(fā)病期的時候，該群由最初的初始細胞占主導向效應記憶型細胞占主導轉(zhuǎn)變，而功能上的最大改變就是，其RORγt的表達及IL-17的分泌顯著提高，表明這群CD4+N

11、KG2D+T細胞可能向CD4+NKG2D+IL-17+T細胞方向分化。在NOD鼠體內(nèi)，該群CD4+NKG2D+T細胞是一群高表達IL-17，高度活化的，效應記憶型炎癥性的CD4+T細胞。
　　第三部分:過表達mInsB15-23H-2Kd對NOD鼠CD4+NKG2D+T細胞生物學特性的影響
　　目的:動態(tài)檢測mInsB15-23H-2Kddtsct真核表達載體干預后NOD鼠體內(nèi)CD4+NKG2D+T細胞頻率，并對該群細胞的功

12、能特點，表型特點，活化狀態(tài)進行進一步研究。在體外探索免疫干預后的該群細胞與CD8+T細胞及CD4+NKG2D-T細胞間作用關系。
　　方法:在NOD鼠3周齡行皮下接種mInsB15-23H-2Kd-SCT真核表達載體(n=18)，以空載體(n=18)及自然NOD鼠(n=18)為對照。在4、5周齡時分別加強一次。在第三次注射后0、1、12、24、48、72h以及1、3、6、9W取小鼠外周血檢測DC(CD11c+)表面H-2Kd表達情

13、況。動態(tài)監(jiān)測過表達mInsB15-23H-2Kd的NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+/CD4+T及CD8+NKG2D+/CD8+T細胞頻率。在20W時，取過表達的NOD鼠外周血，對其CD4+NKG2D+T細胞表面CD107A、FasL、CD44、CD62L、CD69、CD25表達情況，以及胞內(nèi)IFN-γ、RORγt、IL-17A、Perforin、grarzyme B、TGF-β、IL-10分泌情況進行分析。并與發(fā)病前驅(qū)期、發(fā)病期NO

14、D鼠相比較。采用磁珠分選的方法，從免疫的NOD鼠脾臟獲取的純凈CD4+NKG2D+T細胞分別與經(jīng)CFSE標記的純凈的CD4+NKG2D-T細胞、CD8+T細胞共培養(yǎng)。4天后檢測體系中的CD4+NKG2D-T細胞、CD8+T細胞CFSE的熒光強度變化情況。
　　結果:與對照組相比，在第三次注射后的0至72h以及1W之內(nèi)，DC表面H-2Kd的表達均顯著升高且明顯高于對照組。然而在第三次注射后的3W, DC表面H-2Kd的表達驟然降低，

15、并持續(xù)低于對照組。CD8+NKG2D+/CD8+T細胞在6、8W時顯著高于對照組，10W時二者幾乎持平，12W以后一直低于對照組。在6、8、10W時，真核表達載體組CD4+NKG2D+T顯著高于對照組，12W時幾乎持平，14W之后一直低于對照組。過表達mInsB15-23H-2Kd的NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T細胞IFN-γ分泌變化不明顯:在8、10W時高于對照組，12W時與對照組幾乎持平，16W以后一直保持在略低于對照組的水

16、平。20W過表達組較未處理的發(fā)病前驅(qū)期稍有降低，但由于個體差異導致的方差較大，從而導致與發(fā)病期相比沒有統(tǒng)計學意義。過表達mInsB15-23H-2Kd的NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T細胞RORγt及IL-17A變化趨勢一致。在8、10W時RORγt的表達高于對照組，12W時與對照組幾乎持平，16W以后一直保持在略低于對照組的水平。將20W數(shù)據(jù)與發(fā)病前驅(qū)期及發(fā)病期相應周齡數(shù)據(jù)對比，發(fā)現(xiàn)過表達組較未處理的發(fā)病前驅(qū)期稍有降低，與發(fā)病期

17、相比顯著降低。過表達的NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T細胞IL-17A的分泌在8、10、12W時高于對照組，16W以后一直保持在略低于對照組的水平。20W的過表達的NOD鼠較未處理的發(fā)病前驅(qū)期、發(fā)病期均顯著降低。過表達的NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T細胞表達CD107A頻率較發(fā)病前驅(qū)期、發(fā)病期均無明顯變化。而胞漿內(nèi)顆粒酶B(granzyme B)較發(fā)病前驅(qū)期、發(fā)病期均顯著降低。穿孔素（Perforin）較發(fā)病前驅(qū)期、發(fā)病期

18、亦顯著降低。過表達的NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T細胞表達FASL頻率較發(fā)病前驅(qū)期、發(fā)病期均無明顯變化。而TGF-β較發(fā)病前驅(qū)期、發(fā)病期均顯著升高。IL-10較發(fā)病前驅(qū)期、發(fā)病期亦顯著升高。較CD4+NKG2D-T細胞，效應記憶性T細胞的頻率較多，中樞記憶性T細胞與CD4+NKG2D-T細胞相比則略有提升。而初始T細胞頻率則較CD4+NKG2D-T細胞明顯減少。過表達的NOD鼠外周血中的該群細胞較發(fā)病前驅(qū)期、發(fā)病期，CD69表達

19、頻率均升高，CD25表達頻率較發(fā)病前驅(qū)期顯著上升，與發(fā)病期幾乎持平。與單獨的CD8+T細胞相比，加入CD4+NKG2D+T細胞的培養(yǎng)體系中，其CD8+T細胞增殖加快。而CD4+NKG2D-T細胞增殖則無明顯變化。
　　結論:過表達mInsB15-23H-2Kd的NOD鼠外周血中的CD4+NKG2D+T細胞不僅頻率較空載體組及NOD鼠有所降低，該群細胞的活化程度也有一定幅度的增強，并且主要以效應記憶型細胞占多數(shù)。而功能上的最大改變就