甲基化CpG結(jié)合蛋白2對(duì)骨肉瘤生物學(xué)特性的影響和機(jī)制研究.pdf

1、骨肉瘤是最為常見的骨原發(fā)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)。骨肉瘤通常來源于原始的間充質(zhì)來源的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，如股骨遠(yuǎn)端，脛骨近端和肱骨近端，一般好發(fā)于二十歲左右的青年。針對(duì)DNA甲基化的修飾，已成為腫瘤治療的一種新型靶點(diǎn)。DNA高甲基化在促使腫瘤抑制基因沉默的過程中起到了至關(guān)重要的作用，已成為人類癌癥的研究熱點(diǎn)，而這種現(xiàn)象與經(jīng)典的基因突變具有相似的意義。甲基化CpG結(jié)合蛋白(methyl-CpG binding pro

2、teins，MBDs)是招募染色體沉默相關(guān)復(fù)合物結(jié)合到甲基化DNA上的重要橋梁分子，是介導(dǎo)高甲基化DNA抑制基因轉(zhuǎn)錄的重要蛋白家族，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中異常高甲基化區(qū)域的出現(xiàn)使得MBD蛋白可能成為有意義的治療靶點(diǎn)。目前針對(duì)表觀遺傳修飾的藥物最大的缺點(diǎn)是會(huì)引起基因組低甲基化，導(dǎo)致整個(gè)基因組不穩(wěn)定，因此研究以MBD蛋白為靶點(diǎn)的針對(duì)表觀遺傳學(xué)的抗腫瘤治療比以DNA甲基轉(zhuǎn)移酶為靶點(diǎn)的抗腫瘤治療更具特異性，可減少副作用。在前期研究中，我們建立了成

3、骨細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的模型，并利用基因芯片發(fā)現(xiàn)印跡基因TSSC3參與了成骨細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，TSSC3啟動(dòng)子區(qū)呈高甲基化，TSSC3的表達(dá)沉默在骨肉瘤細(xì)胞獲得失巢凋亡抵抗中起著至關(guān)重要的作用。TSSC3作為一種潛在的抑癌基因，可能成為骨肉瘤治療的一個(gè)新靶標(biāo)。我們?cè)O(shè)想，MBD蛋白可能在介導(dǎo)骨肉瘤TSSC3基因表達(dá)沉默中起作用。通常情況下，MBD蛋白，如甲基化CpG結(jié)合蛋白2(MeCP2)，甲基化CpG結(jié)合域1(MBD1)以及MBD2，能夠特異性的

4、結(jié)合甲基化的CpG，同時(shí)與組蛋白去乙酰化酶(HDAC)相關(guān)。甲基化CpG結(jié)合蛋白2(Methyl-CpG-binding protein2，MeCP2)是MBDs蛋白家族中被研究最為廣泛的蛋白。MeCP2是人腦發(fā)育的必需蛋白，而且，MeCP2與許多的癌癥和神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病密切相關(guān)。本研究采用染色質(zhì)免疫沉淀法，首先通過四對(duì)引物檢測(cè)MeCP2蛋白結(jié)合TSSC3基因的活性;然后選擇兩個(gè)特異性siRNA，在LV-MeCP2-RNAi處理過的細(xì)

5、胞中觀察MeCP2基因表達(dá);CCK8檢測(cè)空白LV-MeCP2-RNAi-CN與轉(zhuǎn)染LV-MeCP2-RNAi的SaOS2和U2OS細(xì)胞增殖水平的差異;通過劃痕實(shí)驗(yàn)和Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LV-MeCP2-RNAi對(duì)于U2OS和SaOS2細(xì)胞遷移侵襲能力的影響;應(yīng)用流式細(xì)胞分析U2OS和SaOS2細(xì)胞的凋亡情況;細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LV-MeCP2-RNAi對(duì)于U2OS和SaOS2細(xì)胞的抑制情況;通過建立U2OS和SaOS2裸鼠皮下

6、移植瘤模型，分為轉(zhuǎn)染LV-MeCP2-RNAi組和未轉(zhuǎn)染LV-MeCP2-RNAi組，之后測(cè)量移植瘤的體積;最后通過基因芯片篩選出與MeCP2相關(guān)的具有生物學(xué)意義的差異表達(dá)基因;通過硫化測(cè)序PCR法(Bisulfite Sequencing PCR，BSP)檢測(cè)IGFBP4基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG甲基化水平。目的在于探索MeCP2在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制，并以此為基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)骨肉瘤的新的治療靶點(diǎn)。
　　主要結(jié)果如下:
　　1

7、.染色質(zhì)免疫沉淀法檢測(cè)MeCP2蛋白結(jié)合TSSC3基因的活性，結(jié)果顯示MeCP2在U2OS和SaOS2細(xì)胞中表達(dá)顯著升高，表明MeCP2與TSSC3基因擁有最強(qiáng)的結(jié)合力。
　　2.選擇兩個(gè)特異性siRNA，在LV-MeCP2-RNAi處理過的細(xì)胞中觀察MeCP2基因表達(dá)，與對(duì)照細(xì)胞相比，LV-MeCP2-RNAi能降低MeCP2基因在U2OS和SaOS2細(xì)胞中的表達(dá)，但同時(shí)也降低了TSSC3的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3

8、.CCK8實(shí)驗(yàn)顯示LV-MeCP2-RNAi可抑制SaOS2和U2OS細(xì)胞增殖力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.劃痕實(shí)驗(yàn)和Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LV-MeCP2-RNAi對(duì)于U2OS和SaOS2細(xì)胞侵襲能力的影響，結(jié)果顯示，與空白LV-MeCP2-RNAi-CN轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染LV-MeCP2-RNAi組U2OS和SaOS2細(xì)胞侵襲和遷移能力受到明顯抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)分析了U2OS和SaO

9、S2細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示與空白LV-MeCP2-RNAi-CN轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染LV-MeCP2-RNAi組U2OS和SaOS2細(xì)胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6.細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示LV-MECP2-RNAi可抑制SaOS2和U2OS細(xì)胞克隆形成。結(jié)果提示LV-MeCP2-RNAi抑制U2OS和SaOS2的體外成瘤能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　7.裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)顯示LV-MeCP2-RNAi可抑制SaOS2和U

10、2OS細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　8.通過基因芯片從49395個(gè)轉(zhuǎn)錄子中篩選出107個(gè)差異表達(dá)基因，34基因表達(dá)上調(diào)，73個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。其中5個(gè)基因與骨肉瘤細(xì)胞增殖的功能改變密切相關(guān)，它們包括IGFBP4，HOXC8，LMO4，MDK和CTGF。
　　9.通過硫化測(cè)序PCR法(Bisulfite Sequencing PCR， BSP)檢測(cè)IGFBP4基因的CpG甲基化，結(jié)果顯示IGFBP4基因序列P1區(qū)C

11、pG島顯著的高甲基化。
　　10.LV-MeCP2-RNAi能降低MeCP2基因在U2OS和SaOS2細(xì)胞中的表達(dá)，同時(shí)增高了IGFBP4的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　主要結(jié)論如下:
　　1.在骨肉瘤U2OS和SaOS2細(xì)胞中，三種甲基化CpG結(jié)合蛋白中MeCP2與TSSC3基因擁有最強(qiáng)的結(jié)合力，但這種作用并不是調(diào)節(jié)TSSC3表達(dá)的主要機(jī)制，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
　　2.MeCP2的基因沉默可以阻斷MeC

12、P2的表達(dá)，抑制骨肉瘤U2OS和SaOS2細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移及成瘤能力，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。
　　3.MeCP2基因參與骨肉瘤細(xì)胞的增殖調(diào)控過程。其中IGFBP4、HOXC8、LMO4、MDK和CTGF基因可能參與了MeCP2介導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞增殖的過程。
　　4.骨肉瘤SaOS2細(xì)胞中IGFBP4基因可能是MeCP2的靶向分子，可以通過RNAi阻斷降低MeCP2的表達(dá)水平，恢復(fù)IGFBP4的部分表達(dá)及抑制腫瘤的功能，從而