LSD1小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)及其抑制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲機(jī)制研究.pdf

1、胃癌是世界上發(fā)病率前五的癌癥之一，在致死的癌癥中排第二。胃癌在亞洲發(fā)病率高，男性的發(fā)病率是女性的兩倍，5年生存率低于30％。這樣說(shuō)來(lái)，探索胃癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程和轉(zhuǎn)移侵襲的分子學(xué)機(jī)制的研究十分必要，可以為胃癌的臨床的診斷和治療提供理論基礎(chǔ)。
　　在不同的細(xì)胞過(guò)程中，組蛋白的翻譯后修飾在調(diào)控基因表達(dá)方面扮演重要角色，因?yàn)樗苯佑绊懭旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響了相關(guān)的病理生理?xiàng)l件。組蛋白的甲基化修飾一直被認(rèn)為是靜態(tài)的和不可逆的，直到2004年施楊

2、教授發(fā)現(xiàn)組蛋白去甲基化酶。組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1（Lysine specific histone demethylase1）是首個(gè)組蛋白去甲基化酶，它的功能是去除組蛋白賴氨酸上的甲基，因而調(diào)控了在癌癥進(jìn)程中許多相關(guān)基因的表達(dá)。LSD1在多種腫瘤中高表達(dá)，用抑制劑或RNAi抑制LSD1活性或者降低其表達(dá)可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)，所以，篩選并且獲得高選擇性的小分子LSD1抑制劑是腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是使癌癥致死的重要原因，胃

3、癌的特點(diǎn)是高轉(zhuǎn)移和侵襲。所以，探索癌癥細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲的分子學(xué)機(jī)制十分必要。有文獻(xiàn)報(bào)道，組蛋白甲基化與癌癥轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)基因表達(dá)相關(guān)。然而，在胃癌細(xì)胞中，LSD1與轉(zhuǎn)移侵襲的分子學(xué)機(jī)制仍然不清楚。
　　本課題評(píng)價(jià)了一類結(jié)構(gòu)新穎的含氨基硫脲、端炔結(jié)構(gòu)單元的5-氰基-6-苯基嘧啶類化合物對(duì)LSD1活性，獲得了高選擇性的小分子LSD1抑制劑，并且探索了該化合物在重組蛋白水平的分子學(xué)機(jī)制，深入探索了化合物對(duì)MGC803的EMT過(guò)程的影響，以及L

4、SD1對(duì)TGFβ1調(diào)控的機(jī)制研究。
　　1）化合物對(duì)LSD1活性評(píng)價(jià)以及蛋白水平對(duì)LSD1活性調(diào)控機(jī)制
　　前期LSD1抑制劑篩選采用熒光方法，不需要洗滌或者轉(zhuǎn)移溶液，在同一介質(zhì)中混勻和測(cè)量的特點(diǎn)使得這種方法簡(jiǎn)單、便宜。然而，由于化合物本身基團(tuán)的熒光的干擾使得該方法產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。AlphaScreen是一項(xiàng)通用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，使用同一介質(zhì)檢測(cè)分析物。這項(xiàng)技術(shù)是一個(gè)微珠-微珠靠近的實(shí)驗(yàn)。Donor beads產(chǎn)生的單氧分子可以到

5、達(dá) Acceptor beads，這個(gè)過(guò)程能夠激發(fā)化學(xué)反應(yīng)，最后檢測(cè)生成化學(xué)信號(hào)。
　　LSD1的活性和對(duì)底物特異性是被與LSD1相互作用的蛋白所調(diào)控的。CoREST是一個(gè)重要的與LSD1結(jié)合的蛋白，輔助LSD1與核小體結(jié)合并去除組蛋白的甲基。本課題已經(jīng)完成了截短體的CoREST蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)純化。
　　評(píng)價(jià)了5-氰基-6-苯基嘧啶類化合物對(duì)LSD1的活性，通過(guò)對(duì)化合物進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)了一類新穎結(jié)構(gòu)的LSD1的

6、小分子抑制劑?；衔?b的活性最好，IC50為0.65μM。因此，以下研究的主要研究對(duì)象是化合物6b。
　　在重組蛋白水平，化合物6b抑制LSD1活性，但是對(duì)MAO家族的活性很弱。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)化合物6b對(duì) LSD1具有選擇性。時(shí)間依賴實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明酶與化合物孵育的前8min內(nèi)，不同濃度的化合物的抑制率表現(xiàn)出時(shí)間依賴。BLI檢測(cè)化合物6b與LSD1結(jié)合類型和鍵的強(qiáng)弱，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為化合物6b與LSD1非共價(jià)鍵結(jié)合，Kd為3.7μM。

7、因此，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果闡釋化合物6b與LSD1可能是緊密的可逆的結(jié)合。
　　2）化合物6b抑制MGC803轉(zhuǎn)移侵襲的分子學(xué)機(jī)制研究
　　劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell小室實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，化合物6b能夠濃度依賴的抑制MGC803的轉(zhuǎn)移和侵襲。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，化合物6b能夠濃度依賴的上調(diào)E-cadherin蛋白的表達(dá)，降低N-cadherin蛋白的表達(dá)，從而抑制了MGC803細(xì)胞的EMT過(guò)程。化合物6b可抑制 M

8、GC803中 TGFβ1表達(dá)。同時(shí)構(gòu)建pLVX-shRNA1-LSD1載體并將此載體轉(zhuǎn)染入 MGC803中，上清用Elisa檢測(cè)TGF-β1的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LSD1表達(dá)量降低后，細(xì)胞分泌的TGFβ1量減少。即在MGC803中，LSD1能夠促進(jìn)TGFβ1的表達(dá)。ChIP實(shí)驗(yàn)表明TGFβ1基因被LSD1直接調(diào)控。因此推測(cè)在MGC803中，化合物6b抑制LSD1活性后，減少TGFβ1蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞的EMT過(guò)程，進(jìn)而影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和