力生長(zhǎng)因子對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)作用及機(jī)制研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs）是一類具有多向分化潛能（Multiple differentiation potentiality）的成體干細(xì)胞，能向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及肌細(xì)胞等方向進(jìn)行分化。因其具有取材方便、增殖快速、低免疫原反應(yīng)、能夠分化為多種細(xì)胞、分泌多種生物活性因子以及向損傷組織遷移等優(yōu)點(diǎn)，目前成為細(xì)胞、基因治療以及組織工

2、程等領(lǐng)域方面的研究熱點(diǎn)。
　　在細(xì)胞治療和組織修復(fù)的研究中，BMSCs的誘導(dǎo)分化顯得尤為重要。BMSCs處于復(fù)雜的流體微環(huán)境中，許多研究證明力學(xué)因素在BMSCs的分化過(guò)程中起著重要的作用。力生長(zhǎng)因子（Mechano-growth factor,MGF）是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的組織受損或受力學(xué)刺激過(guò)程中表達(dá)的一種胰島素樣生長(zhǎng)因子（Insulin-like growth factor,IGF-1）選擇性剪接變體。實(shí)驗(yàn)證明MGF及MGF E結(jié)構(gòu)

3、域24肽（羧基端24肽，MGF-E）在保護(hù)受損組織和細(xì)胞、促進(jìn)損傷修復(fù)方面起重要的作用。目前，已有關(guān)于MGF在細(xì)胞分化方面的研究，但MGF在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）的分化過(guò)程中起著怎樣的作用尚不清楚。
　　本文首先研究了MGF-E對(duì)hBMSCs增殖和遷移的影響，在此基礎(chǔ)上著重研究MGF及MGF-E對(duì)hBMSCs分化的影響，繼而研究何種因素在MGF-E誘導(dǎo)hBMSCs的分化過(guò)程中起主要調(diào)控作用。本文的主要工作和研究結(jié)果如下

4、：
　?、費(fèi)GF-E對(duì)hBMSCs增殖和遷移的影響
　　首先，通過(guò)可控的FX-4000T細(xì)胞應(yīng)力加載系統(tǒng)對(duì)hBMSCs施加12％，1Hz的等雙軸周期性力學(xué)刺激，利用Real time RT-PCR（Real time Reverse Transcription–Polymerase Chain Reaction）技術(shù)檢測(cè)MGF-E的表達(dá)。結(jié)果顯示，力學(xué)加載并未對(duì)MGF-E基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。隨后，檢測(cè)外源性添加MGF-E對(duì)h

5、BMSCs細(xì)胞增殖和遷移的影響。結(jié)果顯示MGF-E對(duì)細(xì)胞的增殖速率具有一定的延緩作用。Transwell和創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示25ng/mL和50ng/mL的MGF-E能明顯促進(jìn)細(xì)胞的遷移，100ng/mL的 MGF-E與對(duì)照組相比細(xì)胞的遷移沒(méi)有明顯變化。RT-PCR與Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MGF能促進(jìn)環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）mRNA和蛋白的表達(dá)，COX-2抑制劑NS-398能延緩MGF

6、誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移速率，說(shuō)明MGF可能通過(guò)誘導(dǎo)COX-2的表達(dá)促進(jìn)hBMSCs的遷移。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明力學(xué)加載并未對(duì)hBMSCs中MGF的表達(dá)產(chǎn)生影響；外源性添加MGF-E能促進(jìn)細(xì)胞的遷移，延緩細(xì)胞的增殖速率。
　　②MGF-E對(duì)hBMSCs向成骨、成脂肪及成軟骨方向分化的影響
　　為研究MGF-E對(duì)hBMSCs分化的作用，分別配制成骨、成脂肪及成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基并作為對(duì)照組，以加入20ng/mL MGF-E的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為

7、實(shí)驗(yàn)組，分別進(jìn)行了成骨、成脂肪及成軟骨方向分化的檢測(cè)。培養(yǎng)過(guò)程中誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基每三天更換一次，MGF-E每天添加一次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1）通過(guò)堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,ALP）活性檢測(cè)，ALP染色和茜素紅染色（Alizarin Red S staining）研究了MGF-E在hBMSCs向成骨分化中的作用。
　　2）通過(guò)油紅O（Oil Red O）染色以及RT-PCR技術(shù)研究了MGF-E在hB

8、MSCs向成脂肪分化中的作用。
　　3）通過(guò)免疫熒光染色及酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）技術(shù)研究MGF-E在hBMSCs向成軟骨方向分化中的作用。
　　以上實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明分別向成骨、成脂肪、成軟骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加MGF-E能顯著促進(jìn)hBMSCs向成骨、成脂肪、成軟骨方向分化，這為后續(xù)的研究提供了基礎(chǔ)依據(jù)。
　?、圻^(guò)表達(dá)MGF對(duì)hBMSCs向成

9、骨及成脂肪方向分化的影響
　　為進(jìn)一步研究MGF在hBMSCs分化中的作用，由Invitrogen公司構(gòu)建含有MGF基因的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中擴(kuò)增，隨后轉(zhuǎn)染到hBMSCs中。將轉(zhuǎn)染MGF基因的hBMSCs分別在成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基和成脂肪分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以空白質(zhì)粒為對(duì)照，分別進(jìn)行茜素紅和油紅O組織化學(xué)染色。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后的hBMSCs中MGF的表達(dá)明顯升高。成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)7天后，茜素紅染色顯示誘導(dǎo)后的細(xì)胞產(chǎn)生

10、大量鈣沉積；成脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)7天后，油紅O染色結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的細(xì)胞含有較多的脂肪油滴。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MGF轉(zhuǎn)染后的hBMSCs分別在成骨、成脂肪分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)后其向成骨、成脂肪細(xì)胞分化的能力明顯增強(qiáng)。
　?、躆GF-E通過(guò)延遲細(xì)胞周期促進(jìn) hBMSCs的分化
　　為研究MGF-E誘導(dǎo)hBMSCs分化的調(diào)節(jié)機(jī)制，利用流式細(xì)胞技術(shù)（Flow cytometry assay）檢測(cè)MGF-E對(duì)細(xì)胞周期的影響，并通過(guò)RT-P

11、CR技術(shù)檢測(cè)相關(guān)周期蛋白Cyclin E和cyclin-dependent kinase（CDK2）的表達(dá)情況。流式檢測(cè)結(jié)果顯示生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加MGF-E24小時(shí)后，G1期細(xì)胞數(shù)量明顯增加，說(shuō)明MGF-E將細(xì)胞周期阻滯在G1期，G1期時(shí)間延長(zhǎng)。RT-PCR結(jié)果顯示MGF-E處理24小時(shí)后細(xì)胞周期蛋白Cyclin E、CDK2 mRNA表達(dá)水平明顯下降。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MGF-E可能通過(guò)減少細(xì)胞周期蛋白Cyclin E、CDK2的表達(dá)，將