鼠抗人CD40突變體分子的單克隆抗體的研制及其生物學功能研究.pdf

1、CD40為CD40L的受體，是相對分子質量(Mr)為48000的I型跨膜糖蛋白，屬于神經生長因子受體(NGFR)/腫瘤壞死因子受體(TNFK)超家族成員。CD40主要表達于B細胞、單核/巨噬細胞、樹突狀細胞、造血細胞、上皮細胞、血管內皮細胞及一些腫瘤細胞(如急慢性淋巴細胞白血病，霍奇金淋巴瘤，鼻咽癌，乳腺癌等)也有表達。CD40/CD40L是免疫細胞間重要的信號傳導通路，在B細胞的活化與增殖分化、抗體產生及同種類型轉化中起關鍵作用，在T

2、細胞活化以及效應性細胞因子的分泌過程中也起重要調節(jié)作用。CD40分子介導的信號不僅能對CD40+腫瘤細胞直接發(fā)揮作用，還可通過調節(jié)適應性和固有免疫系統(tǒng)增強機體對表達CD40分子的腫瘤細胞的殺傷效應。目前國際上已有三株人源化抗人CD40單抗進入臨床III期，但其存在的副作用和安全性問題仍引起高度關注。本科室以往的研究發(fā)現(xiàn)一些腫瘤細胞株和新鮮腫瘤細胞表達CD40突變體(CD40mu)(CAC→CAA,78His→78Gln)(NCBI As

3、say Id：ss23134804，Reference SNP Id：rs17177493)，該突變位點位于CD40胞外段第二個富含半胱氨酸的區(qū)域，這一區(qū)域是CD40與CD40L相互作用的重要區(qū)域?；蜣D染細胞的構建進一步證實了該突變體與抗體的結合能力與野生型CD40截然不同，CD40mu胞外段一個氨基酸的突變可導致局部結構改變而形成新的抗原表位，該抗原表位為CD40mu所特有，為此，研制特異性抗人CD40mu分子的單克隆抗體，具備重要

4、的研發(fā)價值。本文研制的mAb3FA、684與10C5是鼠抗人CD40mu單克隆抗體，完全不同于已報道的抗人CD40單克隆抗體，能識別多種腫瘤細胞株(H08910,H460等)以及腫瘤新鮮組織表達的CD40分子，其中10C5不識別血管內皮細胞株Eahy926以及一些正常組織表達的CD40分子，顯示出獨特的應用價值。 1.鼠抗人CD40mu單抗的雜交瘤細胞株的制備 以突變體基因轉染細胞L929/CD40mu為免疫原，免疫BA

5、LB/c小鼠，采用B淋巴細胞融合技術，將反復免疫后的小鼠脾臟細胞與小鼠骨銹瘤細胞SP2/0進行細胞融合，以突變體基因轉染細胞L929/CD40mu為陽性篩選細胞，以野生型CD40基因轉染細胞L929/CD40wt為陰性篩選細胞，通過間接免疫熒光標記法對雜交瘤細胞株進行篩選，經多次克隆化培養(yǎng)，最終獲得3株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人CD40mu單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為3E4、684和10C5，其重鏈分別為IgG2b、IgG1、IgG3，輕

6、鏈為κ鏈。三株抗體均可用于免疫組織化學分析，3E4和10C5可用于Western-blot檢測。雜交瘤細胞株經體外連續(xù)傳代(40代)培養(yǎng)，液氮凍存半年后復蘇，仍生長良好，穩(wěn)定分泌抗體。 2.鼠抗人CD40mu單克隆抗體的體外生物學特性研究 運用制備的單抗檢測發(fā)現(xiàn)，部分惡性B細胞株及上皮性腫瘤細胞株表達CD40mu，其在新鮮腫瘤組織中也有高水平的表達。三株單抗與野生型CD40單抗5C11識別的抗原位點不同，對細胞株的識別譜

7、也不相同。不同于已報道的抗人CD40單克隆抗體，三株單抗能識別多種腫瘤細胞株(H08910,H460等)以及腫瘤新鮮組織表達的CD40分子，其中10C5不識別血管內皮細胞株Eahy926以及一些正常組織表達的CD40分子。繼而采用抗CD40mu單抗對表達CD40mu的人卵巢癌細胞株H08910的體外實驗初步表明，單抗3E4能夠促進HO8910細胞的體外生長，單抗10C5能夠抑制HO8910細胞的體外生長，并且促使其凋亡。 綜上所