朵麗蝶蘭生物鐘相關(guān)基因DhLHY的克隆與功能驗(yàn)證.pdf

1、朵麗蝶蘭(Doritaenopsis hybrid)是蝴蝶蘭(Phalaenopsis)與朵麗蘭(Doritis)的雜交種,是蘭科蝴蝶蘭屬多年生附生草本花卉;因其花形酷似蝴蝶、花色豐富艷麗,花期長(zhǎng)達(dá)3~4個(gè)月,在國(guó)內(nèi)外花卉市場(chǎng)上深受歡迎,被譽(yù)為“蘭中皇后”,是蘭科植物中栽培最廣泛、應(yīng)用最普及的種類之一,具有較高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
　　本次試驗(yàn)通過對(duì)蝴蝶蘭文庫中LHY相關(guān)序列的搜索分析,以朵麗蝶蘭‘Tinny Tender’(D

2、oritaenopsis‘Happy smile× Happy valentine’)為試材,利用基因克隆技術(shù)獲得DhLHY基因的cDNA全長(zhǎng),對(duì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析并驗(yàn)證其功能。研究主要取得以下結(jié)果:
　　1.利用PCR技術(shù)克隆獲得朵麗蝶蘭中DhLHY基因的cDNA全長(zhǎng);DhLHY基因的cDNA序列全長(zhǎng)2594bp,包括一個(gè)1962bp的ORF區(qū),編碼653個(gè)氨基酸。
　　2.通過實(shí)時(shí)定量PCR分析比較低溫和高溫條件下,

3、植物根、莖、葉中 mRNA表達(dá)量的變化,解析生物鐘基因 DhLHY的表達(dá)機(jī)理,分析 DhLHY基因表達(dá)的時(shí)空分布,結(jié)果顯示 DhL HY基因在24h內(nèi)表達(dá)量隨著光照時(shí)間的變化發(fā)生改變,在光照2h后表達(dá)量達(dá)到高峰,之后隨著光照時(shí)間增加,表達(dá)量逐漸下降,在傍晚時(shí)分達(dá)到低谷,進(jìn)入暗期后,表達(dá)量又開始緩慢上升;在整個(gè)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段, DhL HY在根、莖和葉中都有檢測(cè)到表達(dá),且表達(dá)量變化不顯著,在低溫處理時(shí),DhLHY的表達(dá)量高于高溫處理。

4、>　　3.采用蘸花法侵染擬南芥,將構(gòu)建的 pC1301-DhLHY過量表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中,利用潮酶素篩選轉(zhuǎn)基因擬南芥植株并觀察記錄其表型變化,結(jié)果表明,DhLHY轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的葉型與野生型相比,葉柄縮短,葉片變小,植株的開花時(shí)間也有不同程度的延遲,在轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)均能檢測(cè)到 DhLHY基因的 DNA和RN A,這一結(jié)果與擬南芥中的研究報(bào)道大致相同。
　　本研究對(duì)于實(shí)現(xiàn)通過基因工程手段來人工控制蝴蝶蘭開花的時(shí)間、突破蝴